胰岛素百年路：小小蛋白，四届诺奖｜世界糖尿病日
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奖金一分为二，二分为四
联合国糖尿病日之所以选定在11月14日，是为了纪念胰岛素的发现者弗雷德里克·班廷（Frederick Banting）——这一天是他的诞辰。
话说1919年，参加完一战的班廷退役了，并在迷茫中修完了多伦多大学的医学学位。由于没找到工作，他干脆回老家开诊所。传说这家诊所在开业20多天后才迎来第一位病患/顾客，生意自然是做不下去了，班廷就跑到当地的西安大略大学谋了个兼职教师的工作，主要是讲点解剖学和生理学。
1920年10月，学校给他安排了关于糖代谢的课。班廷原本是门外汉，为了养家糊口，也只能硬着头皮上。他找来大量文献备课，发现糖尿病与胰脏的关系很早就被证实了，而且怀疑跟胰岛有关。但由于胰岛的分泌物很少，并且很容易分解，因此还没有人成功分离过。碰巧的是，当时的一篇期刊上正好介绍了胰腺结石。在病例中，患者的结石阻塞了胰管，回流的胰液导致胰腺萎缩，可胰岛却留存完好，并且也没有引发糖尿病。
班廷来了灵感：这个病例一方面说明胰岛中有能防止糖尿病发生的物质，另一方面，如果按照同样的思路，把动物的胰管结扎让胰脏萎缩，剩下的部分里，应该就能提取出可以降血糖的这种物质。他把这些想法记在了1920年10月31日的笔记上。
紧接着，班廷跑到多伦多大学游说当时的糖代谢专家麦克劳德（John Macleod）。麦克劳德大概是觉得人和动物的降糖物质不可能一样，要么就是觉得眼前这个连工作都差点找不到的人，不存在任何概率获得前人分离不到的物质，所以他起初不为所动。
但班廷没有放弃，他不辞往返几百公里的辛劳，有空就跑到多伦多忽悠麦克劳德。到1921年暑假，麦克劳德似乎被班廷说服了，他觉得即使搞不出什么真东西，至少可以发篇论文。于是在回苏格兰老家度假前，麦克劳德把实验室钥匙留给了班廷，一起留下的还有十条狗和学生查尔斯·贝斯特（Charles Best）——这么并列有点怪……
不知道是不是对自己的手艺过于自信，等来机会的班廷一把就将十条狗的胰管全部结扎。不幸的是，这批狗狗很快就都死了。
考虑到必须高效利用麦克劳德休假的空窗期，班廷卖掉了自己的诊所，换来钱不断买狗狗做实验。他的坚决感动了贝斯特，为了省钱，贝斯特不计报酬地跟班廷对狗进行外科手术。他们把狗狗萎缩的胰脏切片，并在冷冻状态下研磨，然后加入生理盐水提取，再将提取液注射到被摘除了胰脏的糖尿病狗狗体内。经过多次实验，提取液起作用了：注射后，狗狗的血糖下降；停止注射，血糖升高。
麦克劳德闻讯结束休假，回到实验室了解情况。在知晓班廷和贝斯特的全套实验后，他意识到，降糖的物质，搞不好还真的人狗同源，甚至哺乳动物都同源。作为老谋深算经验丰富的专家，他提出了三条建议：
第一，从屠宰场弄牛胰腺来做提取——不杀狗，省钱；
第二，把提取物注射进健康的兔子体内，如果兔子低血糖，那就能证明有效——不杀狗，省钱；
第三，把化学家詹姆斯·克里普（James Collip）拉入团队，帮助提纯胰岛素。
麦克劳德的合理化建议让项目进展神速，到年底，团队提取胰岛素的纯度和速度都极大提高，够得上做出来给人用了。
1922年1月11日，一位14岁的加拿大少年在人类历史上第一个接受了胰岛素治疗。原本只有几个月预期寿命的他，后来活到了27岁。当然，不是胰岛素不给力，而是这个年轻人死于车祸。同年，美国时任国务卿休斯的女儿伊丽莎白·休斯也接受了胰岛素治疗。在治疗前，15岁的小女孩体重只有20公斤，治疗后她恢复了健康，最终活到了75岁，并育有三个子女。
临床上取得成功的胰岛素，让班廷名声大噪。第二年，32岁的他就跟麦克劳德一起分享了1923年的诺贝尔生理学或医学奖，此时距他开始胰岛素的研究仅仅两年。班廷不仅是诺奖历史上最快获奖之一，还保持着生理学或医学奖的最年轻得主纪录。美中不足的是，两位得主略有龃龉。
班廷认为麦克劳德一开始不认可自己的想法，不应该获奖，倒是一直跟自己做实验的贝斯特应该得奖。拿到奖金后，他给贝斯特分了一半。麦克劳德也“投桃报李”，拿出自己奖金的一半，给了帮助提纯胰岛素的克里普。
取下项链上的珍珠
神仙打架的事情，咱们凡人说不清，继续说回胰岛素。
最开始的胰岛素药品，是从动物中提取制成的，但它在临床应用上难免有问题。比如容易触发人体免疫反应，产生抗体后降低疗效不说，在部分患者身上甚至还会产生副作用。最主要的，这种提取得来的胰岛素，产量太低、药价太高，无法满足大众对胰岛素的需求。但由于当时还没有人弄清胰岛素的结构，自然无法通过人工合成来批量生产。
想弄清结构，得有纯的胰岛素，可当时市售的胰岛素药品，纯度只有10%左右，差得有点远。
最早得到胰岛素晶体的人，是美国化学家艾贝尔（John Jacob Abel）。
1925年，他使用镀锌容器引入关键的锌离子，幸运地得到了胰岛素的晶体，却又不幸地认为得到的结晶只是小分子“抑糖激素”的载体。
1926年3月之后，也许是换了容器，艾贝尔再也没有得到胰岛素晶体，他只能放弃对胰岛素本质的思考。几年后，胰岛素结晶化中锌的秘密被揭开，对其结构的探索才重新推进。
既然胰岛素是蛋白，那么到底是哪些氨基酸，按照什么顺序组成胰岛素呢？来自剑桥的青年教师桑格（Frederick Sanger）为世人揭开了这个谜团。
1943年，刚拿到博士学位的桑格，面临的问题是在20种氨基酸的排列组合中，找到属于胰岛素的那种组合。这听上去像是玩拼图游戏，可如果是在2020这种数以亿计的组合中，寻找正确的那一块拼图的话，简直无异于大海捞针。
在导师的建议下，桑格决定从鉴定胰岛素的氨基入手。他设想，如果能找到一种标记物紧紧结合在氨基上，鉴定氨基就容易很多。最后，他找到了2,4-二硝基氟苯，也就是桑格试剂，缩写为DNFB。
DNFB与氨基酸紧密结合显出黄色，不同的结合产物，在纸层析上会停留在不同位置，仅比较位置，就能确定DNFB结合的是哪个氨基酸。更重要的，这种结合产物不易被水解。这样，从一段蛋白的N端开始，桑格可以用DNFB把氨基酸一个个摘下来，就像从珍珠项链上逐颗拿下珍珠。
1945年，桑格先让DNFB与胰岛素反应，再用盐酸完全水解，发现两种氨基酸被标记，这说明胰岛素由两条肽组成。1951年，胰岛素B链上30个氨基酸的序列得到确定。1953年，胰岛素A链上21个氨基酸的序列得到确定。又用了三年时间，桑格解决了水解过程中二硫键的交换等问题，完成了二硫键位置的确定。1954年，胰岛素的一级结构终于完全解析。
这是第一个被解析出结构的蛋白，桑格也成为世界上第一个解析蛋白质中氨基酸序列的人。
1958年，桑格独享了诺贝尔化学奖，获奖理由毫无悬念：
for his work on the structure of proteins, especially that of insulin.
值得一提的是，桑格还因为独立发展出DNA测序方法，而分享了1980年的诺贝尔化学奖。
看清蛋白的模样
胰岛素的氨基酸序列有了，接下来的问题是，胰岛素是什么“形状”的？
1934年，还在读博的多萝西·霍奇金（Dorothy Hodgkin）得到了一块胰岛素晶体，这在当时可是稀罕玩意儿。尽管此时的多萝西还要等三年才能拿到博士学位，但她已是X射线衍射技术鉴定分子结构方面的专家。可惜早期的仪器分辨率太低，她拍出的第一张胰岛素晶体照片无法确定分子的精细结构。
多萝西只能先把X射线衍射技术的强大威力“发泄”在其他生物分子上。1945年，她解出类固醇和青霉素的结构。
作为人类药物史上鼎鼎大名的抗生素，青霉素的结构在很长时间内存在争议，不少科学家都提出了自认为合理的结构。大浪淘沙后，仅剩下噻唑-唑酮结构、β-内酰胺结构和三环结构经受住了考验。多萝西的研究证明了β-内酰胺结构的正确性，但为了稳妥起见，这项研究在1949年才发表。
1955年，多萝西利用X射线衍射解析出维生素B12的结构。在多萝西之前，人类还没有任何手段来确定如此巨大的分子的结构。
1964年，多萝西因“用X射线技术确定重要生化物质的结构”而独享诺贝尔化学奖。
故事还没结束。
不忘初心的多萝西在获得诺奖五年后，最终破译了胰岛素的结构——由三个二聚体组成的六聚体。
此时距离她拍下第一张胰岛素晶体照片已经过去了35年。
从分子走向临床，揭秘糖尿病
对胰岛素分子的研究在推进，对胰岛素临床使用的研究也有进展。随着疗法的推广，不少医生发现，对很多糖尿病患来说，仅仅是简单使用胰岛素还不够。糖尿病可能远比人们认为的要复杂。
很早之前，就有人注意到糖尿病人之间存在的巨大差异。有些年轻患者，身体瘦弱，即使对饮食进行低糖控制，也很难存活。而那些中年后才确诊为糖尿病的患者，通常身形肥胖，经过良好的饮食控制，生存率会明显提高。
胰岛素疗法普及后，医生们又惊奇地发现，相比于中年糖尿病患者，年轻患者需要更少的胰岛素剂量就能起到控制血糖的作用。这些现象说明，糖尿病从原理上讲并不单一，至少可以分为胰岛素敏感型和非敏感型。
20世纪50年代，美国物理学家雅洛（Rosalyn Yalow）开发出放射性免疫分析法（radioimmunoassay，RIA），确定了胰岛素与II型糖尿病之间的关系。
雅洛检测了两类糖尿病病人的血液胰岛素含量，结果发现胰岛素非敏感型病人的血液中含有胰岛素，并不是之前认为的胰岛素缺陷。这项工作不仅开发出多肽类激素的检测方法，也直接促进了人类对于糖尿病的病理学认识。
糖尿病主要分为两大类：I型糖尿病通常在儿童时期发病，是一种自身免疫性疾病，患者胰腺分泌的胰岛素很少或根本不产生胰岛素；II型糖尿病患者的身体不能很好地利用胰岛素，无法将血糖维持在正常水平。I型糖尿病约占病例的10%，II型糖尿病约占病例的85%-90%，而在II型糖尿病中，除胰岛素分泌受损之外，肥胖是最主要的诱因。
1977年，雅洛获得诺贝尔生理学或医学奖。据说，她研究胰岛素的动力，除开学术上的考虑之外，还因为她的丈夫也是一名糖尿病患者。
结语
根据国际糖尿病联盟发布的全球糖尿病地图，目前全球成年（20-79岁）糖尿病患者约为5.37亿，预计到2030年将达到6.43亿；每年因糖尿病死亡的人数为670万，平均每5秒钟就有一人因糖尿病而死去，这让我们不得不加强对糖尿病的关注。
从班廷发现胰岛素至今已历百年，治疗糖尿病的新药陆续被研发，但说到底，控制好体重，保持健康的生活方式，才是远离糖尿病的王道。
参考文献
[1]维基百科相关词条
[2]Insulin: Discovery and Controversy. Clinical Chemistry. 48 (12): 2270–2288
[3]Frederick Grant Banting (1891–1941) Codiscoverer of Insulin. Journal of the American Medical Association. 198 (6): 660–61. 1966
[4]Frederick Sanger (1918–2013) Double Nobel-prizewinning genomics pioneer. Nature. 505 (7481): 27.
[5]Nobel lecture: The chemistry of insulin (PDF), Nobelprize.org
[6]In Memoriam: Dr. Rosalyn Yalow, PhD., 1921–2011. Molecular Endocrinology. 26 (5): 713–714.
[7]Dorothy Crowfoot Hodgkin (1910–1994). Protein Science. 3 (12): 2465–69.
[8]100 years of insulin: celebrating the past, present and future of diabetes therapy. Nature Medicine. 27: 1154–1164(2021).
[9]Celebrating 100 years of insulin. Diabetologia. (2021) 64:944–946.
[10]https://diabetesatlas.org/
本文经授权转载自微信公众号“科学大院”，原标题为《一种蛋白，四个诺奖，两位女性》。
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