Sci Adv︱徐勇/徐平稳/何彦林合作发现雌激素受体神经元调节体温和运动的神经环路机制 ​

撰文︱叶   慧

责编︱王思珍

近年来，对于雌激素（estrogen）及其调节体重、能量代谢作用的研究，已经成为肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等领域的关注热点[1, 2]。据有关报道，雌激素通过减少采食[3]、增加运动、提高能量消耗[4]、以及改善脂肪分布[5]等方式，对抵御肥胖起到举足轻重的作用。有研究表明，雌激素受体α（ERα，雌激素受体主要亚型之一）是雌激素抗肥胖活性的关键结合受体[5]。ERα组织特异性基因敲除小鼠的研究进一步证明，在大脑中表达的ERα在维持能量代谢平衡，以及控制体重中起到了至关重要的作用[6]。其中，在大脑下丘脑腹内侧核的腹外侧亚区（vlVMH）中，有神经元大量表达ERα受体（ERα^vlVMH神经元）。研究证明，这群表达ERα受体的神经元在雌激素的作用下能够刺激能量消耗，以及维持血糖平衡[6, 7]。然而，迄今为止，人们对上述ERα^vlVMH神经元的下游神经通路参与的代谢功能调控机制还知之甚少。

2022年1月19日，来自美国贝勒医学院的徐勇博士、伊利诺伊大学芝加哥分校的徐平稳博士、路易斯安那州立大学潘宁顿生物医学研究中心的何彦林博士研究团队合作在Science Advances杂志上发表了一项题为“An estrogen-sensitive hypothalamus-midbrain neural circuit controls thermogenesis and physical activity”的重要研究成果。该研究发现，腹外侧亚区→中缝背核（vlVMH→DRN）的ERα^vlVMH神经元环路参与调解体温和能量代谢。这一研究成果推进了我们对神经内分泌和女性代谢健康机理的认知，也为针对代谢紊乱，尤其是绝经期后女性所体现的相关症状的医学干预，提供了必要且新颖的思路。

该合作团队首先利用雌性转基因小鼠（ERα-ZsGreen）荧光标记表达ERα受体的神经元，并应用电生理的方法记录了所标记的ERα^vlVMH神经元对雌二酮（E2）的反应（图1 A-E）。结果显示100 nm 17ß-estradiol (E2) 能够显著地增强所测神经元的脉冲频率以及静息电位，从而证明了雌激素能够激活ERα^vlVMH神经元。为了进一步研究ERα^vlVMH神经元的生理学作用，该团队利用了化学遗传学技术（DREADD）特异性激活了ERα^vlVMH神经元。作者通过脑立体定位技术将AAV-DIO-hM3Dq-mCherry病毒直接注射到Esr1-Cre（Esr1为ERα的编码基因）小鼠的vlVMH脑区，实现了在ERα^vlVMH中特异性过表达人毒蕈碱乙酰胆碱M3 受体的一种修饰变体hM3Dq（图1 F）。hM3Dq不再结合乙酰胆碱，但可被氯氮平-N-氧化物（Clozapine N-oxide，CNO）特异性激活，参与Gq信号通路从而释放细胞内储存的钙，增强神经元的兴奋性。作者通过在hM3Dq过表达小鼠中腹腔注射CNO来特异性激活ERα^vlVMH神经。实验结果显示，特异性激活ERα^vlVMH神经元能过显著提高雌性小鼠的自发运动，体温以及褐色脂肪产热（图1 G-J）。此外，研究人员进一步发现长期特异性激活ERα^vlVMH神经元能够显著降低由高脂日粮和卵巢切除引起的肥胖症（图1 H-L）。这部分研究证明了 ERα^vlVMH对调控能量代谢平衡有着积极作用。

图1 化学遗传学激活 ERα^vlVMH神经元增强机体运动以及褐色脂肪生热。

（图源：Ye H, et al., Sci Adv,  2022）

为了进一步追踪ERα^vlVMH神经元的下游神经通路，研究人员首先将跨突触顺行病毒 Ad-iN/WED注射了到了Esr1-Cre小鼠的vlVMH脑区（图2 A & B），该病毒能够将其所包含的绿色荧光蛋白表达到ERα^vlVMH及其下游神经元。随后免疫组织化学染色结果表明，大量的绿色荧光蛋白在中脑中缝背核（DRN）脑区的神经元中表达（图2 C）。同时，绝大部分DRN绿色荧光蛋白标记神经元为五羟色胺（5-HT）神经元 ，即5-HT^DRN神经元（图2 D & E）。为了进一步确认ERα^vlVMH→5-HT^DRN为单突触传导的神经回路，研究人员采用了神经示踪逆向跨单突触病毒组合，包括缺陷型重组狂犬病毒EnvA-glycoprotein (G)–deleted Rabies-mCherry和腺相关病毒Cre-dependent helper AAV virus AAV2-EF1a-FLEX-GT [enhanced GFP (EGFP) + TVA] （图2 F）。该狂犬病毒融合了重组的禽类肉瘤病毒的外膜蛋白（EnvA），能够特异性识别EnvA的受体TVA（TVA只存在于禽类细胞中，在哺乳动物神经元中无表达）。值得一提的是，该狂犬病毒同时缺失了囊膜糖蛋白（glycoprotein，G），G蛋白是狂犬病毒逆行跨突触所当必须的蛋白。在G蛋白缺失的情况下，狂犬病毒会丧失跨突触能力，但其复制以及转录并不会受到影响，并且可逆向高亮度标记神经元形态。利用Cre-Loxp在特定区域特异性神经元中表达TVA，缺陷型重组狂犬病毒能够实现对特异型神经元的逆向标记。在此研究中，研究人员首先将 AAV2-EF1a-FLEX-GT（EGFP + TVA）注射至Esr1-Cre小鼠的vlVMH脑区，TVA特异性地表达在ERα^vlVMH神经元的胞体及其下游神经纤维末梢。随后，他们将EnvA-pseudotyped glycoprotein (G)–deleted Rabies-mCherry病毒注射至ERα^vlVMH神经元的下游脑区，即DRN脑区，从而定位ERα^vlVMH神经元的神经末梢。狂犬病毒的EnvA特异性识别了在ERα^vlVMH神经纤维末梢中表达的TVA，并介导狂犬病毒特异性地感染结合了投射到vlVMH脑区的ERα^vlVMH神经元（图2 F-I）。实验结果发现Rabies-mCherry（红色荧光）与TVA-GFP （绿色荧光）共同表达在小鼠的vlVMH脑区（图2 J-L）。这一结果表明中脑中缝背核脑区的五羟色胺神经元，为ERα^vlVMH神经元直接投射的下游神经回路之一。

图2 ERα^vlVMH神经元通过单突触传导调控5-HT^DRN神经元。

（图源：Ye H, et al., Sci Adv,  2022）

为了进一步探索ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路的突触传导机制，该研究团队采用了光遗传辅助神经环路示踪（CRACM）技术。研究人员首先将AAV-DIO-ChR2-EYFP以及Ad-iN/WED病毒特异性地注射到Esr1-Cre/TPH2-iCreER/Rosa26-LSL-tdTOMATO小鼠的vlVMH脑区（图3 A）。该小鼠模型利用TPH2-iCreER（TPH2，全称Tryptophan Hydroxylase 2，五羟色胺合成所必须的关键性酶）和Rosa26-LSL-tdTOMATO（tdTOMATO报告基因）特异性地将红色荧光（tdTOMATO）标记在五羟色胺神经元中。与此同时，AAV-DIO-ChR2-EYFP病毒将ChR2（channelrhodopsin-2，光敏感通路蛋白）特异性地表达于ERα^vlVMH神经元及其下游神经末梢，并且显现黄色荧光。与之前提及的相同，跨突触顺行病毒Ad-iN/WED将WGA-GFP（绿色荧光）特异性地标记在ERα^vlVMH神经元及其分布在DRN的下游神经，包括5-HT^DRN 神经元。其中，多达91.49%的记录神经元为 tdTOMATO（+）WGA-GFP （+），即同时显现红色以及绿色荧光（图3 B & C）， 表明这些神经元为接受ERα^vlVMH直接调控的下游5-HT^DRN神经元。在随后进行的膜片钳电生理记录中，研究人员制备了同时包含上游vlVMH和下游DRN的脑片，并利用DRN 特异性蓝色激光激活上游ERα^vlVMH神经元，同时记录下游tdTOMATO（+）WGA-GFP （+）DRN神经元的电生理信号。实验结果表明，即使在河豚毒素（TTX，电压门控钠离子通道抑制剂，可以抑制动作电位发放）抑制下，蓝光刺激仍能够显著增强该组神经元的静息电位（图3 D & E）。这一系列研究结果表明：ERα^vlVMH神经元能够直接传导兴奋性输入至5-HT^DRN神经元。研究人员还监测到，大部分的tdTOMATO（+）WGA-GFP（+）受测神经元存在兴奋性突出后电位（eEPSC）。并且，在将待测小鼠脑片给予突触前信号阻断剂预孵育后，所观测到的eEPSCs依旧存在（图3 I & J）。然而，由光刺激所引起的eEPSCs能够被谷氨酸递质受体拮抗剂D-AP5（NMDA受体的拮抗剂）与CNQX（AMPA受体的拮抗剂）所阻断，从而揭示了ERα^vlVMH神经元主要通过谷氨酸神经递质来调节其下游的5-HT^DRN神经元。结合上述结果，该研究证明了ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路的突触传导是通过谷氨酸神经递质来实现的。

  图3 ERα^vlVMH→DRN神经环路通过谷氨酸神经递质激活5-HT^DRN神经元。

（图源：Ye H, et al., Sci Adv,  2022）

为了进一步了解 ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路的生理学意义，研究人员重点观测了在不同环境温度或营养状态下，这一特定神经环路的电生理活性。该实验中，他们利用了 ERα-ZsGreen/Rosa26-LSL-tdTOMATO小鼠将ERα（+）神经元标记为绿色荧光， 同时在DRN脑区注射了逆行追踪CAV2-Cre病毒（图4 A）。该病毒能够逆行追踪到上游脑区 （即vlVHM脑区）从而表达Cre并特异性将红色荧光（tdTOMATO）标记到vlVMH神经元。这样一来，DRN的上游ERα^vlVMH神经元就同时被标记了绿色以及红色荧光而显现为黄色荧光，即 ERα（+）CAV/tdTOMATO（+）。随后，研究人员将小鼠暴露于不同温度或营养状态下，并制备包含vlVMH的脑片运用于下一步的膜片钳记录。实验结果表明，ERα（+）CAV/tdTOMATO（+）神经元的自发放动作电位频率在冷暴露（4°C ）中得到了提升，而在热暴露（40°C ）中有所下降（图4 B & C）。神经元靜息膜电位在热暴露组中明显降低了，却在冷暴露中没有显著的变化（图4 D）。研究人员同时发现，过夜禁食能够显著降低该组神经元的自发放动作电位频率和超级化神经元细胞膜靜息膜电位，并且禁食后2小时饲喂就能够完全恢复神经元的动作电位发放频率和去极化神经元细胞膜靜息膜电位（图4 E-G）。这一系列结果揭示了，低温环境下，投射至DRN的 ERα^vlVMH神经元的活性提高，而在高温或禁食状态下，该特定神经元的活性被抑制。科研人员进一步研究了雌激素对该组神经元动态活性的作用，他们发现卵巢切除能够阻断由外界温度或营养状态引起的神经元活性变化（图 4 B-G），这表明了雌激素在该特定神经元的温度和营养传感功能中起到关键作用。

图 4 投射到DRN脑区的 ERα^vlVMH神经元在不同温度及营养状态下的动态活性。

（图源：Ye H, et al., Sci Adv,  2022）

随后，为了更深入地探索ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路对能量代谢的调控作用，研究团队将Cre-dependent的 AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到Esr1-Cre小鼠的上游vlVMH脑区中，同时在下游DRN脑区中埋置了光导纤维（图5 A）。在该实验条件下，ChR2能够表达在ERα^vlVMH神经元及其下游神经纤维中，直接作用于DRN脑区的光刺激能够特异性地激活ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路。实验如图所示（图 5 B-E & G），蓝光刺激DRN脑区显著提高小鼠的自发运动以及褐色脂肪温度。这一部分研究验证了ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路对小鼠产热以及机体运动的调节功能。另外，研究团队发现β3-肾上腺素受体拮抗剂SR59230A 并不能够有效地阻断蓝光刺激引起的褐色脂肪生热以及机体运动增强（图5 C, D, F, G）。归纳以上结果，ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路调控褐色脂肪生热以及机体运动这一生理作用不依赖于 β3-肾上腺素受体。

  图 5  ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路激活褐色脂肪生热并刺激机体运动。

（图源：Ye H, et al., Sci Adv,  2022）

最后，研究人员重点研究了投射到DRN的ERα^vlVMH神经元中表达的ERα在雌性小鼠的能量代谢调控中发挥的作用。在此部分研究中，他们采用的是逆行示踪基因敲除技术 （图6 A），在不影响细胞总数的情况下，将投射到DRN的上游神经元中（即ERα^vlVMH神经元）所表达的ERα敲除（图6 B-D）。随后的实验结果显示， ERα 敲除的小鼠，其褐色脂肪发热以及机体运动都显著地被抑制（图6 E & F）。另外，经过两周高脂食物的喂养，该实验组小鼠的体重也呈现了显著地升高，但其能量摄入并没有明显的变化（图6 G & H）。这一结果验证了投射到DRN的ERα^vlVMH神经元中表达的ERα受体在雌性小鼠的能量代谢调控中有着不可或缺的作用。

图 6 投射到DRN的ERα^vlVMH神经元中表达的ERα在雌激素调控褐色脂肪生热以及机体运动中所起的关键作用。

（图源：Ye H, et al., Sci Adv,  2022）

图8 机制示意图

（图源：徐勇/徐平稳/何彦林合作科研团队）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究利用神经环路示踪、电生理学、化学遗传学、光遗传学、基因敲除等多种技术，揭示了ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路特异调节小鼠产热和机体运动。激活这一由雌激素所介导的神经回路，能够增加褐色脂肪产热和机体运动，从而抑制小鼠的体重增加。该研究揭示了ERα受体表达的神经元与雌激素以及神经系统的 “互动“机理，并且阐明了外界环境因素如何调节ERα^vlVMH→5-HT^DRN这一特定神经环路，从而维持能量代谢的平衡（图8）。这说明该神经环路很可能是一个重要的治疗肥胖和代谢疾病的药物靶点，具有重大的临床价值。

当然， 这项研究还有一些未解答的科学问题。比如ERα^vlVMH→5-HT^DRN神经环路是通过什么机制来增加褐色脂肪产热和机体运动，还有待进一步研究。值得一提的是， 有研究表明雌激素能够通过激活视前区（POA）雌激素敏感神经来介导食物匮乏引起的的核心体温急剧下降，代谢率和运动显著降低[8]。有关雌激素如何通过调控两种作用截然相反的神经通路来控制体温和能量代谢还有待进一步研究。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abk0185

伊利诺伊大学芝加哥分校的叶慧博士为本文第一作者，贝勒医学院的徐勇博士，伊利诺伊大学芝加哥分校的徐平稳博士，路易斯安那州立大学潘宁顿生物医学研究中心的何彦林博士为本文共同通讯作者。其他参与研究者包括伊利诺伊大学芝加哥分校的蒋玉炜博士，贝勒医学院王春梅博士，孙正博士，德州州立大学健康研究中心休斯顿校区（UT Health Science Center at Houston）童青春博士等。此项研究受多项来自美国国立卫生院（NIH）、美国农业部（USDA）以及美国心脏协会（AHA）经费支持。

叶慧（左一），徐勇博士（左二），徐平稳（右二），何彦林（右一）

（照片提供自：徐勇/徐平稳/何彦林合作科研团队）

何彦林博士课题组长期得到美国国立卫生研究院（简称NIH）的资助，经费充足。目前招收博士后和访问学者，请感兴趣的同学发送简历至[e-mail]联系。实验室介绍链接如下：https://www.pbrc.edu/research-and-faculty/faculty/He-Yanlin-PhD.aspx

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参考文献（上下滑动查看）  

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制版︱王思珍

本文完