Cell Death Dis︱张小磊/王向阳/周一飞课题组揭示免疫应答基因1/衣康酸对于脊髓损伤的保护作用及相关机制
撰文︱倪励斌，张小磊
责编︱王思珍
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是临床上常见的创伤性疾病，是全球致残和死亡的主要原因之一，但目前尚没有令人满意的治疗方法和策略[1]。炎症反应是脊髓损伤中最主要的病理因素之一，其贯穿整个病理过程并可导致神经损伤区域的扩大和神经功能的进一步丧失[2]。三羧酸（TCA）循环在炎症反应和组织损伤的过程中发挥着重要的作用，TCA循环中免疫应答基因1（immune-responsive gene 1，Irg-1）及Irg-1调控的代谢产物衣康酸（itaconate），由于其在调控炎症和诱导免疫耐受方面的作用受到广泛关注[3-5]。然而，Irg-1/衣康酸在脊髓损伤中的作用以及其作用机制尚不明确。
2022年2月10日，温州医科大学附属第二医院骨科/浙江省骨科学重点实验室在Cell Death & Disease上发表了题为“Immune-responsive gene 1/itaconate activates nuclear factor erythroid 2-related factor 2 in microglia to protect against spinal cord injury in mice”的文章，倪励斌、肖剑和张迪为论文共同第一作者，周一飞主任、王向阳主任、张小磊研究员为论文共同通讯作者。研究证明Irg-1与脊髓损伤的病理进展相关联，激活Irg-1或通过外源性补充Irg-1调控的代谢产物衣康酸，可通过激活Nrf2通路抑制脊髓损伤后的组织炎症，并促进脊髓损伤小鼠的功能恢复，为脊髓损伤的治疗带来新策略和新方法。
首先，研究人员从GEO数据库中筛选数据，在数据集GDS2159/1427381中作者发现，在小鼠脊髓损伤后的24小时内，损伤部位的Irg-1基因表达量显着增加（图1 A）。随后，研究人员提取脊髓损伤小鼠脊髓组织的RNA及蛋白，通过qRT-PCR及Western blot检测，再一次证明了Irg-1的表达量在小鼠脊髓损伤后升高（图1 B-E）。在体外实验中，作者以脂多糖（LPS）刺激的小胶质细胞，发现Irg-1蛋白的表达量也呈现明显的上升趋势，且与小胶质细胞的炎症水平成正相关（图1 F-I）。所有的这些结果表明：Irg-1与脊髓损伤的病理过程存在相关性，且其表达量随着炎症水平的增加而增加。
图1 脊髓损伤小鼠和LPS刺激的小胶质细胞中Irg-1表达增加
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了研究Irg-1与脊髓组织炎症之间的相关性，作者采用慢病毒沉默或者过表达小胶质细胞中的Irg-1，并通过qRT-PCR、Western blot和ELISA检测小胶质细胞的炎症水平（图2 A）。结果发现，在沉默Irg-1之后，炎症相关蛋白的mRNA和蛋白表达水平都显著增加，而过表达Irg-1的结果则相反，表明Irg-1在LPS诱导的小胶质细胞炎症中起保护作用（图2 B-L）。
图2 Irg-1可减少由LPS诱导的小胶质细胞炎症
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了探索Irg-1的抗炎作用机制，作者分离细胞核蛋白和细胞质蛋白，分别检测其中的Nrf2通路蛋白。结果表明在过表达Irg-1之后，细胞核中的Nrf2和细胞质中的HO-1及NQO1表达有所升高（图3 A-B），后续细胞免疫荧光的结果也进一步印证了这一点（图3 C-D）。而在使用siRNA干扰Nrf2之后，Irg-1的抗炎作用则有所下降（图3G-J）。这些结果提示：Irg-1可以激活Nrf2通路，并依赖Nrf2发挥其抗炎保护作用。
图3 过表达Irg-1激活Nrf2通路
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
通过体外实验，研究人员发现Irg-1可以激活Nrf2通路，对小胶质细胞具有保护作用。为了进一步研究Irg-1的体内作用效果，研究人员将慢病毒注射到小鼠脊髓组织中以沉默或过表达Irg-1，通过行为学（BMS评分、斜板实验、步态实验）（图4 C-G）、组织形态学（HE染色、Nissl染色）（图4 H-I）及组织免疫荧光（图4 J-K）等技术评估小鼠功能恢复的情况。与对照组（LV-ctrl）相比，过表达Irg-1脊髓损伤小鼠运动功能恢复更好，存活的神经元数量更多，且组织炎症的水平更低。以上实验结果表明：激活Irg-1可以促进脊髓损伤后小鼠功能的恢复。
图4 Irg-1促进脊髓损伤后小鼠功能恢复
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
通过体内外的研究，研究人员发现Irg-1在脊髓损伤的病理过程中呈现上升的趋势并发挥着保护作用。而Irg-1作为一种线粒体酶，可调控细胞代谢产生一种名为衣康酸的代谢产物，为了研究衣康酸作为Irg-1调控的代谢物是否具有与Irg-1相同的保护作用，研究人员使用了一种可渗透细胞膜的衣康酸衍生物，4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate，4-OI）（图5A）[6]。实验结果发现，在加入4-OI之后，小胶质细胞的炎症水平明显下降（图5 D-L）。
图5 衣康酸减少LPS诱导的小胶质细胞炎症
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
小胶质细胞的极化水平与其炎症水平密切相关，作者进一步检测了衣康酸处理下小胶质细胞的极化水平。实验结果发现，4-OI抑制了由LPS引起的M1型标志物ba-1的升高和小胶质细胞的形态变化（图6 A-C, G）。结合衣康酸可以抑制iNOS、COX2和IL-6的表达（图5 G-L），所有这些现象均表明衣康酸可以抑制小胶质细胞的M1极化。此外，免疫荧光、Western 和 qRT-PCR的结果表明，4-OI抑制CD68的表达升高并促进Arg-1的表达（图6 C-E）。此部分结果表明衣康酸促进了小胶质细胞向M2型极化。
图6 衣康酸抑制M1型小胶质细胞极化，促进M2型极化
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
在脊髓损伤过程中，M1小胶质细胞会产生和释放炎症介质，从而对神经元造成损伤。为了进一步研究衣康酸对神经细胞的保护作用，作者使用Transwell系统共培养小胶质细胞和神经细胞（PC12细胞）。Western blot的结果表明，在LPS诱导的M1型小胶质细胞共培养下，神经细胞Bcl2表达量下降，而Bax和Cleave-caspase3表达水平增加（图7 A-B），表明神经细胞的凋亡增加。而在加入了4-OI之后，凋亡水平则有所下降，TUNEL染色和细胞免疫荧光也进一步印证了这一点（图7 C-F）。综上所述，这些结果表明衣康酸可以减少由M1型小胶质细胞引起的神经元凋亡。
图7 衣康酸减少由 M1小胶质细胞引起的神经细胞损伤
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
既然过表达Irg-1可以激活Nrf2通路，那么衣康酸作为Irg-1调控的代谢产物是否也能激活Nrf2通路？后续的研究结果（图8）表明，衣康酸也可以激活Nrf2通路，并依此发挥其保护作用。
图8 衣康酸激活Nrf2通路
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
体内实验方面，作者在SCI+4-OI组小鼠腹腔注射50 mg/kg剂量的4-OI，而其他小鼠腹腔注射相同体积的DMSO溶液。实验结果（图9）表明，外源性补充衣康酸与过表达Irg-1一样，都可以保护脊髓损伤后脊髓组织内的神经元，促进脊髓损伤小鼠的运动功能恢复。
图9 衣康酸促进脊髓损伤后小鼠的功能恢复
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
图10 模式图：Irg-1/衣康酸通过激活Nrf2通路促进脊髓损伤恢复
（图源：Ni LB, et al., Cell Death Dis, 2022）
当然，这项研究还存在一些有待解决的问题。脊髓损伤后微环境的变化极为复杂，目前尚不能完全模拟脊髓损伤后微环境的变化[7]。此外，相较于体外，小鼠脊髓损伤后Irg-1的表达峰值更短，这可能是由于衣康酸表达增加后对Irg-1的负反馈抑制，而这种负反馈作用可能会影响Irg-1/衣康酸更好地发挥其作用。如何克服这一负反馈机制，更好地让Irg-1/衣康酸发挥其保护作用以及Irg-1/衣康酸在临床治疗中的应用方法还需要进一步研究。
总之，该研究提示Irg-1与脊髓损伤的病理进展过程相关，而靶向激活Irg-1以及运用衣康酸可能是治疗脊髓损伤的潜在策略（图10）。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41419-022-04592-4
倪励斌硕士（左），第一作者 ；王向阳主任（中），共同通讯作者；张小磊研究员（右），共同通讯作者。
(照片提供自：浙江省骨科学重点实验室)
温州医科大学附属第二医院骨科/浙江省骨科学重点实验室倪励斌（左）、肖剑、张迪为本文共同第一作者，周一飞主任、王向阳主任（中）、张小磊研究员（右）为本文的通讯作者。研究工作得到了温州市科技局基金（Y2020056、ZY2019014）、浙江省医药卫生科技专项基金（2020KY638）及贺林院士新医学临床转化工作站科研基金（18331213）的支持。
【1】J Neuroinflammation︱唐勇课题组发现运动通过提高海马内小胶质细胞糖代谢和形态可塑性改善AD认知功能下降
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【3】Sci Adv︱徐勇/徐平稳/何彦林合作发现雌激素受体神经元调节体温和运动的神经环路机制
【4】PNAS︱韩春课题组揭示外部吞噬引发神经元退化的新机制
【5】Nat Neurosci︱VTA多巴胺能神经元参与编码社交预测误差与社交强化学习
【6】Nature︱新发现！炎性淋巴细胞或是介导中枢神经系统炎症的新靶点？
【7】Neurosci Bull︱胡波课题组揭示投射至腹内侧丘脑的小脑深核神经元特异参与联合型感觉-运动学习行为的调控
【8】Nat Neurosci︱伍龙军课题组揭示渐冻人症关键病理蛋白TDP-43的新配体——TREM2
【2】多模态磁共振脑网络分析入门班（线上：2022.4.6~4.16）
参考文献（上下滑动查看）
1.Badhiwala JH, Wilson JR, Fehlings MG. Global burden of traumatic brain and spinal cord injury. Lancet Neurol. 2019;18(1):24-5.
2.Orr MB, Gensel JC. Spinal Cord Injury Scarring and Inflammation: Therapies Targeting Glial and Inflammatory Responses. Neurotherapeutics. 2018;15(3):541-53.
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5.Liu X, Qiao Y, Ting X, et al. Isocitrate dehydrogenase 3A, a rate-limiting enzyme of the TCA cycle, promotes hepatocellular carcinoma migration and invasion through regulation of MTA1, a core component of the NuRD complex. Am J Cancer Res. 2020;10(10):3212-29.
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制版︱王思珍
本文完