Commun Biol︱姚金晶等人揭示2型尼兰碱受体的亚细胞分布及对神经兴奋性和记忆能力的影响
撰文︱姚金晶
责编︱王思珍
2型尼兰碱受体（ryanodine receptor 2，RyR2）是一种存在于内质网上的钙离子释放通道，在心肌细胞和神经元等可兴奋性细胞的兴奋性调控中发挥着重要的作用[1]。既往关于RyR2的研究主要集中在其活性对心肌兴奋性及心律调控等的影响，而多种RyR2功能亢进型突变与儿茶酚胺能多形性室性心动过速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT）密切相关[2]。在神经系统中，已有的研究表明，在RyR受体家族成员中，RyR2是在脑组织中表达丰度最高的一种亚型，尤其是在海马及皮层等与学习记忆密切相关的区域[3-6]。前期研究表明，在学习记忆形成的过程中，RyR2的mRNA水平及蛋白质水平均有增加，这提示RyR2的功能与学习记忆的形成以及相关区域的神经元突触可塑性调节有着密切的关系[7-10]。而CPVT相关的RyR2突变同样被证实能够导致智力障碍（intellectual disability，ID）的发生，但其具体的机制仍不明确。除此以外，由于缺乏针对RyR2的特异性抗体（已有抗体仍存在着与其他亚型，如RyR1、RyR3的交叉反应），对我们详细了解RyR2在神经元中亚细胞水平的分布带来了极大的困难。
2022年3月2日，加拿大卡尔加里大学的Wayne Chen教授实验室在《Communications Biology》上发表了题为“Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory”的最新研究成果，表明在小鼠海马的CA1锥体神经元和齿状回颗粒神经元中，RyR2大量表达于神经元的胞体及树突主干中，而未能在神经元树突棘及突触前末梢检测到其表达。与之相对应的，CPVT相关的RyR2功能亢进型突变——RyR2-R4496C——能够导致海马CA1神经元兴奋性上升，CA3-CA1突触连接长时程增强（LTP）形成能力减弱，并导致小鼠整体学习记忆能力下降，但不影响该连接的突触前易化能力。研究提示由于RyR2集中分布于神经元胞体及树突主干，因此其活性升高可导致的突触后神经元兴奋性增加，从而减弱突触连接LTP形成的能力，最终导致学习记忆能力的下降。Florian Hiess博士、姚金晶博士为该项工作的共同第一作者。（拓展阅读：Alzheimers Dement︱姚金晶等发现阿尔兹海默症的新治疗靶点：2型尼兰碱受体活性介导的神经元兴奋性增加）
为了排除其他亚型的干扰，特异地研究RyR2亚型在神经元中的分布，作者构建了融合有绿色荧光蛋白的RyR2基因突变小鼠（GFP-RyR2），同时，制备了针对GFP的新型探针（GFP-nanobody）。通过免疫组化、高分辨率显微成像、活细胞双光子成像等技术，作者发现RyR2与微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）有着较好的共定位，但与突触前末梢特征蛋白synaptophysin和树突棘特征蛋白phalloidin无明显共定位（图1）。这表明在CA1锥体神经元及齿状回（dentate gyrus，DG）颗粒神经元中，RyR2集中表达在神经元的胞体和树突主干中，但并不显著表达于树突棘及突触前末梢。
图1 RyR2在海马CA1锥体神经元内的分布
（图源：Hiess F, Yao J, et al., Commun Biol. 2022）
与此同时，作者构建了携带有CPVT相关RyR2功能亢进型突变的RyR2-R4496C+/-小鼠，通过双光子钙成像实验和膜片钳记录表明，RyR2-R4496C+/-突变能够导致海马CA1锥体神经元胞体及树突主干处自发动作电位频率显著上升（图2）。进一步的电生理实验记录表明，RyR2-R4496C+/-突变能够通过降低CA1锥体神经元上A型钾电流（IA）的密度实现对神经元兴奋性的上调。
图2 RyR2-R4496C+/-突变改变CA1锥体神经元兴奋性
（图源：Hiess F, Yao J, et al., Commun Biol. 2022）
而借助脑片电生理记录实验表明，RyR2-R4496C+/-突变能够导致海马CA3-CA1突触连接LTP形成能力降低。行为学检测同时提示，RyR2-R4496C+/-突变导致小鼠学习记忆能力下降（图3 ）。电生理记录结果同时提示，RyR2-R4496C+/-突变并不影响CA3-CA1连接突触前易化（paired pulse facilitation）形成的能力（图4）。这与我们并未在突触前末端检测到RyR2的表达相印证。
图3 RyR2-R4496C+/-突变导致CA3-CA1连接LTP形成能力降低
（图源：Hiess F, Yao J, et al., Commun Biol. 2022）
图4 RyR2-R4496C+/-突变不影响CA3-CA1连接paired pulse的形成
（图源：Hiess F, Yao J, et al., Commun Biol. 2022）
综上所述，该项工作结合免疫组化、高分辨率成像、钙成像、电生理及遗传操作等手段，发现在小鼠海马CA1锥体神经元及齿状回（DG）颗粒神经元中，2型尼兰碱受体（RyR2）特异地分布于神经元的胞体和树突主干，但在神经元的树突棘和突触前末梢并未检测到其表达。与之相对应的，RyR2活性增强能够导致突触后神经元兴奋性增加，胞体及树突主干处自发动作电位频率上升，但不影响突触前神经元功能。整体上，RyR2活性增强可导致小鼠学习记忆能力下降。通过该研究，帮助我们从空间和功能上，更好地理解了RyR2在神经元中的分布及其对神经元兴奋性、学习记忆能力调控的可能机制。同时，实验所构建的小鼠模型也为我们研究RyR2在中枢神经系统中其他区域的特异性表达提供了新的、有力的研究平台，为我们下一步深入研究RyR2活性变化对整体神经网络系统功能的调节奠定了基础。
同时，基于现有实验技术的精度和可操作性，作者并不能完全排除RyR2在树突棘和突触前末梢的表达。现有的结论仅基于现有实验条件所能达到的精度，随着实验手段的不断发展，作者期待能够在更精确的水平上完善对RyR2在亚细胞水平分布的研究。此外，除了海马CA1锥体神经元及DG颗粒神经元外，其他类型神经元（如CA3锥体神经元、抑制性中间神经元等）都有检测到RyR2的表达，因此，RyR2活性改变对整体动物学习记忆能力的影响不能简单地归结于CA1锥体神经元兴奋性的改变，CA1锥体神经元的相关变化仅作为我们理解RyR2活性变化对整体神经系统功能影响的一个窗口，后续仍需要更深入、全面的研究对其机制加以认识和解读。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s42003-022-03124-2
（照片提供自Wayne Chen实验室）
加拿大卡尔加里大学博士生Florian Hiess（左）、研究助理姚金晶博士（中）为本文第一作者，Wayne Chen教授（右）为通讯作者。本项研究受加拿大健康研究院（CIHR）经费支持。
【1】Nature︱新发现！海马体空间选择性的局部回路放大作用
【2】PNAS︱周健等人揭示Rett综合征及相关神经发育疾病的共同分子机制
【3】J Neuroinflammation︱章京课题组揭示帕金森病患者单核细胞免疫超活化新机制：携带α-syn红细胞来源胞外囊泡
【4】Nat Protoc︱无线光遗传学器件在解析行为神经编码中的巨大应用前景
【5】Science︱单细胞测序揭示小鼠小脑细胞顺式调控元件的发育和进化动力学
【6】Neurosic Bull︱SACT模板：针对学龄儿童的弥散张量模板及其效度验证
【7】Cereb Cortex︱刘玉和/张语轩团队揭示左右侧人工耳蜗植入的发展差异
【8】Neuron︱王立平团队揭示睡眠与恐惧调控的“共享”神经环路
【1】科研技能︱磁共振脑网络分析入门班（线上：2022.4.6~4.16）
【3】多模态磁共振脑网络分析入门班（线上：2022.4.6~4.16）
【4】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会 （2022.4.2-3 腾讯在线会议）
参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完