Nat Protoc︱无线光遗传学器件在解析行为神经编码中的巨大应用前景

撰文︱杨翌元，武名政

责编︱王思珍 

探索人类神经活动的内在原理以及其与行为的因果关系需要一套既可以让科研人员实时控制神经系统活动又同时不影响实验动物的正常行为的综合性实验系统。这对目前的生物医学器件领域提出了巨大的挑战。

光遗传学（optogenetics）是一项融合了光学及遗传学等多学科的技术，应用特定波长的光来控制特定神经细胞活动。通常该技术利用转基因方法[1]将视原蛋白（opsins，一种自然中存在的光控跨膜离子通道）表达于特定细胞群体。这些转基因细胞（细胞活动）在接受到合适的波长的光刺激后会被激活或者抑制。相较于之前大量使用的电刺激或药物刺激，光遗传学方法为靶向操作特定的细胞类型，提供了更高的时间和空间精度。

传统的光遗传学方法依赖于半导体和工业生产的光纤（optical fibers）或微型无机发光二极管（micro-inorganic light emitting diodes，µ-ILEDs）作为光源。在实验中，光纤可以作为通道将外部的光源导入特定的区域，而µ-ILEDs（~10 µm）则可以作为局部光源来激活单体细胞。然而，在动物实验中，这些方法依赖于外界的物理连接（光缆）或大重量头戴式电池平台来进行电充能和信号传输，大大影响了实验动物的自然运动，也阻碍了动物之间正常的社交行为。因此，目前光遗传学方法并没有广泛地应用于复杂且深奥的行为学实验中。

2022年2月16日，美国西北大学（Northwestern University）的John A. Rogers课题组和Yevgenia Kozorovitskiy课题组合作在Nature Protocols发表了题为“Preparation and use of wireless reprogrammable multilateral optogenetic devices for behavioral neuroscience” 的实验方案文章（Protocol），阐述了如何在不影响动物正常行为的情况下实现对大脑神经元实时的光遗传学控制，并构建了一套完善的动物行为学实验体系来探究更深层次的神经活动和宏观行为之间的联系。杨翌元（Yiyuan Yang）和武名政（Mingzheng Wu）为共同第一作者。

基于电感耦合原理而形成的传输线圈和接收线圈之间的无线能量传送，可以提供可持续性的电能。该方法可以取代电池和所有形式的外在连接，从而不影响实验动物的正常行为。该论文在实验中采取此原理并构建试验系统。

在实验中，连接电源并环绕在动物围栏周围的传输线圈为小型植入器件提供在无线电广播的谐振频率（13.56 MHz）下的磁场能量。与此同时，小型可植入器件包含了一个匹配的接收线圈来利用磁场能源给器件中相应的电学，光学元件进行持续性充能。图1展示了该可植入型器件[2]。除去在器件边缘的接收线圈，该器件中心区域还包含了微控制器（micro-controller）、近场通信记忆芯片（NFC memory）等有源电子元件 （active electronic components），以及电阻、电容、二极管（Schottky diodes）等无源电子元件（passive electronic components）。探针顶端的µ-ILEDs将作为局部的光源来刺激大脑特定区域的神经元。所有元件会包覆在聚对二甲苯（parylene）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双层保形封装（conformal coating）内，从而保证了器件在体内的长时间工作并降低机体对器件本身的排异反应。

图1：头部植入的无线光遗传学器件。

（图源：Yang Y, et al., Nat Neurosci, 2021）

该器件平台可以让实验人员通过定制的软件来对实现实时的近场通讯控制，以此来调整光刺激的频率（frequency）、强度（intensity）、负载率（duty cycle）、以及刺激模式（illumination modality）。这项突破大大提升了光遗传学器件在行为学实验中的应用前景，使以往很难探索的，关于不同个体神经元活动对社会行为的影响的实验成为可能。

作者在之前的研究中使用这套系统，成功揭示了内侧前额叶皮质（mPFC）的脑间同步性活动在促进动物亲社会行为中的关键作用[2]。与此同时，该平台也将闭路控制系统（closed-loop system）在光遗传行为学实验中成为可能：对神经元或其它细胞形成基于内部生理信号或宏观行为观测的自动化刺激。此功能的实现将在不久的将来让光遗传学器件应用于神经方面的医学治疗领域。最新的这篇Nature Protocols代表作阐述了利用闭路控制系统实现基于检测膀胱非正常排尿现象的指向光遗传学治疗技术[3]。此外，这篇Nature Protocols文章还详细介绍了制作和植入器件的流程，同时也公开了实验装置的设立以及软件代码，让更多的实验组可以享受并利用最新的研究成果[4]。

该Nature Protocols文章还提出了一种双部器件（two-part device）的设计理念：将电子控制系统（electronic module）和光刺激区域（stimulation site）物理分开，并采用柔性蜿蜒金属线 （soft metal serpentine traces）进行电路链接。此设计理念打破了常规的无限光遗传学所面临的空间限制，让设计者可以将electronic module放在动物体内空间更加充足的地方，从而显著提升能源采集效率并提供充足的空间给电子元件来进行功能升级。该文章展示了一种代表性的背部植入器件（图3）。该器件将电子控制系统植入在背部来控制脑部植入的含有µ-ILED的探针。

图3：背部植入的无线光遗传学器件

（图源：Yang Y, et al., Nat Protoc, 2022）

实现此概念必须要保证柔性蜿蜒金属线能够承受足够的、日常由于个体体态变化导致的重复性的形变。图3所示的器件中的蜿蜒金属线采用了柔性电子所使用的光刻和转印技术，实现了将钛（Ti，20 nm）/铜（Cu，300 nm）/钛（Ti 20 nm）/金（Au 50 nm）的金属薄膜刻印成蜿蜒形态来保证其在50%的单轴拉伸形变中，依然处于材料的弹性形变区间。与此同时，该金属线封装与上下对称的蜿蜒结构的Parylene，来保证其在弯曲形变中，将应变降至最低。实验中，该器件能够在身体内维持长达9周以上的机械稳定性[2]。 

与此同时，该文章同样公开了此器件的制作和植入流程，以方便科研人员借鉴和使用（图4）。

图4：背部无限光遗传器件的制作和植入流程

（图源：Yang Y, et al., Nat Protoc, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，探索神经网络活动的内在基本原理和其与宏观行为之间的关系一直是科学家们所好奇并执着研究的工作。最新出现的光遗传学方法让科学家们可以在非常高的时空精度上控制神经系统活动。在此基础上，该论文提出的无线电广播频率无线光遗传器件平台（包含器件设计、制作、植入和实验装置设立），极大地提升了光遗传学器件在行为学实验方面的应用，尤其是社会行为学方面的研究。与此同时，该论文提出的双部器件设计为将来在光遗传学器件中添加不同种类的生物传感器提供了蓝本。在不久的将来，科学家们可以实现在动物实验中激活/抑制神经系统活动的同时监测动物体内不同位置，不同种类的生理信号，来更近一步探索神经活动和其导致的行为结果的内在原理。

然而，目前为止，该平台还局限于应用在小鼠（mice）或者大鼠（rat）等小型啮齿类动物的行为学实验中。由于电感耦合的能量传输效率限制，如果将该平台应用于大型类人动物，比如猴子、猪等，或应用于活动范围广阔的动物中，比如鱼、鸟等，该平台依然会极大限制这些动物的正常活动从而导致行为学实验的不准确。另外，虽然双部器件的设计极大突破了空间对于能源采集的限制，但该器件设计将带来更大的植入体积以及手术创伤，未来能否直接应用于人类医疗依然未可知。最后，该平台依赖于µ-ILED作为局部光源刺激神经元，然而目前为止µ-ILED的电光转换效率依然低下，尤其是在535 nm ~ 590 nm这个区间，效率仅为6%左右[2]。如果用该器件平台激活大空间范围的神经元，过大的输出功率会导致局部温度的骤升，从而影响神经元的正常活动并造成细胞组织损伤[5]。因此，无线光遗传器件在未来还有巨大的提升空间。未来基础科学的方面的进步和工程制作工艺上的提升，都将提升无线光遗传学器件的能量采集和光刺激的效率，同时降低器件的体积和手术创伤，为未来在人类医疗方面的应用做好准备。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-021-00672-5

杨翌元（左）、武名政（右）为论文共同第一作者

（照片由自撰稿作者本人提供）

致谢：This work utilized Northwestern University Micro/Nano Fabrication Facility (NUFAB), which is partially supported by Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205), the Materials Research Science and Engineering Center (DMR-1720139), the State of Illinois, and Northwestern University. C.H.G. is supported by the LUCI program, sponsored by the Basic Research Office, Office of Under Secretary of Defense for Research and Engineering (USD R&E). Y.K. is supported by the NIH R01MH117111 and R01NS107539, and Beckman Young Investigator Award. M.W is supported as an affiliate fellow of the NIH T32 AG20506 and 2021 Christina Enroth-Cugell and David Cugell Fellow. Z.X. acknowledges the support from the National Natural Science Foundation of China (grant no. 12072057), LiaoNing Revitalization Talents Program (grant no. XLYC2007196) and Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. DUT20RC(3)032). Y.H. acknowledges support from NSF (CMMI1635443).

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1. Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E. et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci 8, 1263–1268 (2005). https://doi.org/10.1038/nn1525

2. Yang, Y., Wu, M., Vázquez-Guardado, A. et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nat Neurosci 24, 1035–1045 (2021). https://doi.org/10.1038/s41593-021-00849-x

3. Mickle, A.D., Won, S.M., Noh, K.N. et al. A wireless closed-loop system for optogenetic peripheral neuromodulation. Nature 565, 361–365 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-018-0823-6

4. Yang, Y., Wu, M., Wegener, A.J. et al. Preparation and use of wireless reprogrammable multilateral optogenetic devices for behavioral neuroscience. Nat Protoc (2022). https://doi.org/10.1038/s41596-021-00672-5

5. Owen, S.F., Liu, M.H. & Kreitzer, A.C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nat Neurosci 22, 1061–1065 (2019). https://doi.org/10.1038/s41593-019-0422-3

制版︱王思珍

本文完