J Neurosci︱曹雄/孙向东课题组合作揭示调控焦虑样行为的新机制：中央杏仁核环氧化物阳性神经元

撰文︱任静，卢成林，孙向东，曹雄 

责编︱王思珍

焦虑障碍（anxiety disorders）是最为普遍的以焦虑情绪为主的精神疾病，主要表现为发作性或持续性的担心、忧虑、恐惧和紧张等焦虑情绪，并伴有自主神经系统功能紊乱、肌肉紧张与运动不安等症状[1-2]。据《柳叶刀·精神病学》2019年发布的中国精神卫生调查显示：焦虑障碍的患病率及终生患病率在所调查精神疾病及药物滥用中最高[3]。此外，重大公共卫生安全等应激事件——如目前的新型冠状病毒疫情，在社会和个人的心理层面上引发了严重的焦虑等不良情绪，导致群体心理危机。因此，焦虑障碍严重危害人类的生命与健康，已成为一个公共健康问题。然而，焦虑障碍长期以来得不到足够的重视，发病机制研究较少；对其发病机制了解的匮乏进一步限制了其临床诊断和治疗方法的发展。

大脑富含不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），它们对神经系统和心血管系统具有重要的保护作用。花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）是其核心通路之一，其中可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）是该通路的关键酶[4]。sEH主要表达于大脑星形胶质细胞，有趣的是，中央杏仁核（central amygdala，CeA）的部分sEH表达于神经元；CeA是焦虑症神经环路研究的关键脑区[5]。此外，也有文献报导sEH基因全身敲除鼠表现出焦虑样行为[6]，提示sEH可能参与调节焦虑样行为。那么，CeA的sEH, sEH阳性神经元及其环路如何调节焦虑样行为？本文将从分子、细胞、环路三个水平研究sEH在焦虑样行为中的调节机制。

2022年2月1日，南方医科大学的曹雄课题组和广州医科大学的孙向东课题组合作在Journal of Neuroscience上发表了题为“A Distinct Metabolically Defined Central Nucleus Circuit Bidirectionally Controls Anxiety-Related Behaviors”的文章，从分子、细胞、环路水平系统地阐述了CEA的sEH与焦虑样行为的关系，明确了sEH表达于CeA神经元；sEH分子及sEH阳性神经元参与调节焦虑样行为；并鉴定出sEH阳性神经元参与调节焦虑样行为的投射环路。南方医科大学的任静博士和卢成林博士为论文第一作者，曹雄教授和孙向东教授为论文通讯作者。

sEH是环氧花生四烯酸信号通路的关键酶，有研究提示sEH广泛表达于小鼠大脑的星型胶质细胞；有趣的是，sEH表达于焦虑症的关键脑区—中央杏仁核（CeA）神经元[7]。为了明确sEH在CeA神经元上的表达，本研究使用了sEH特异性抗体，采用免疫荧光双标记技术，与神经元特异的抗体NeuN在C57BL/6J成年小鼠脑片上进行共染；结果发现，sEH和NeuN共定位表达在CeA脑区（图1 A）。为了进一步确认sEH表达于CeA的神经元上，本文使用了以sEH蛋白的基因Ephx2作为启动子并带有Cre重组酶的Ephx2-iCreER^T2转基因小鼠，并与荧光报告工具鼠Rosa26-LSL-tdTomato小鼠交配获得Ephx2-tdTomato（Ephx2-iCreER^T2;Rosa26^loxp/-）报告鼠。在Ephx2-tdTomato鼠脑片上，荧光免疫标记NeuN和s100β，结果发现，在CeA区域有58% sEH阳性细胞与神经元（NeuN阳性表达细胞）共定位表达，34%sEH阳性细胞与胶质细胞（s100β阳性表达细胞）共定位表达（图1 B-D）。以上结果表明sEH表达于CEA的神经元，明确了它在焦虑症关键脑区中央杏仁核的定位。进一步探索sEH在CeA表达的神经元类型，本研究采用RNAscope技术，其结果显示sEH表达在CeA区域主要的三种GABA神经元的比例分别是：CRF（17.6±5.5%）、Somatostatin（SOM；25.3±5.1%）、PKCδ（31.6%±5.8%）（图1 E-F）。

图1 sEH表达于CeA神经元且与焦虑样行为具有相关性

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了探索sEH是否参与调节焦虑样行为，本文采用成年的C57BL/6J小鼠通过高架十字迷宫实验（EPM）和新环境压抑进食实验（NSF）筛选出先天性原始焦虑小鼠。与低焦虑组小鼠相比，高焦虑小鼠在高架十字迷宫实验和新环境压抑进食实验中均表现出明显的焦虑样行为（图1 G-I）。分离高低焦虑两组小鼠CeA脑组织，提取RNA，并采用实时荧光定量PCR技术检测CEA的sEH基因的表达水平。分析结果发现，与低焦虑组小鼠比较，高焦虑小鼠CeA脑区sEH的mRNA表达水平明显降低且两组小鼠的mRNA水平与其在高架十字迷宫实验中的行为成正相关（图1J-K）。这提示sEH可能参与调节焦虑样行为。

图2 抑制CeA sEH的表达导致焦虑样行为

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为探索CeA的sEH是否参与调控焦虑样行为，研究人员采用了药理学手段的干预方法；在C57BL/6J的成年小鼠一侧或者双侧CeA植入微量注射套管，术后14天handle小鼠，术后21天在CeA给予sEH抑制剂（TPPU），检测小鼠的行为表现（图2 A, G）。结果发现，与给予对照溶剂（ACSF）的小鼠相比，给予1uM浓度的TPPU（2 μL/只）小鼠在高架十字迷宫实验中开臂滞留的时间显著减少，在闭臂滞留的时间显著增加（图2 B, H）；且在新环境压抑进食实验中TPPU组小鼠第一次去吃食物的时间（latency to feed）也显著增加，而小鼠的食欲无明显差异（图2 C-D, I-J）；在旷场实验中，小鼠的运动能力及在中心区域停留的时间无明显差异（图3 E-F, K-L）；提示药物抑制CeA的sEH可导致焦虑样行为。

图3 敲低CeA sEH的表达导致焦虑样行为

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

由于药理学实验的非特异性，本文使用特异性更好的重组腺相关病毒来干扰CeA的sEH表达，并检测其对焦虑样行为的影响。研究者采用立体定位技术在成年C57BL/6J小鼠大脑双侧CeA注射AAV-Ephx2-shRNAs(pAKD-CMVbGlobin-eGFP-H1-shRNA)，共聚焦图片显示eGFP阳性的细胞均表达在CEA区域；蛋白免疫印迹结果也表明sEH的蛋白表达水平显著降低（图3 A-B）。焦虑样相关行为检测结果发现，与对照组小鼠比较，在高架十字迷宫实验（EPM）中，与对照组小鼠比较，病毒干扰组的小鼠在开臂滞留时间显著降低（图3 C）；在新环境压抑进食实验中，sEH病毒干扰组小鼠第一次去吃食物的时间显著增加，而食欲无显著差异（图3 D-E）；在旷场实验中，两组小鼠的运动能力及中心区域停留的时间均无显著差异（图3 F-G）。综上结果进一步提示CeA的sEH参与调节焦虑样行为。

图4 条件性敲除CeA神经元上的sEH导致焦虑样行为

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了探究CeA神经元的sEH是否也参与调节焦虑样行为，研究者使用了Ephx2^loxp/loxp小鼠，采用立体定位技术在两侧CeA区域注射以神经元为启动子（Syn）的Cre病毒（AAV-pAOV-hSyn-EGFP-2A-CRE病毒）和对照病毒AAV-pAOV-hSyn-EGF，Cre重组酶表达后，可以特异地敲除神经元上的Ephx2。共聚焦图片显示EGFP均表达在CeA区域神经元，蛋白免疫印迹结果也表明sEH的蛋白表达水平显著降低（图4 A-B）。高架十字迷宫实验（EPM）结果发现，与对照组小鼠比较，cKO小鼠在开臂滞留时间显著降低（图4 C）；在新环境压抑进食实验中，与对照组小鼠比较， cKO小鼠第一次去吃食物的时间显著增加，食欲无显著差异（图4 D-E）；在旷场实验中，两组小鼠的运动能力及中心区域停留的时间均无显著差异（图4 F-G）。以上结果表明CeA神经元上的sEH参与调节焦虑样行为。

图5 抑制sEH表达降低sEH阳性神经元的兴奋性

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022） 

为探索sEH调控神经元活动机制，作者使用Ephx2-iCreER^T2;Rosa26^loxp/-转基因小鼠的进行急性切片，将CeA区域的脑片放置在以2 ml/min的流速持续灌注人工脑脊液的记录槽中，形成稳定形成全细胞膜片钳记录模式，在人工脑脊液中加入sEH的抑制剂TPPU（工作浓度1 uM）或对照溶剂，记录sEH阳性神经元的各电生理特性。结果显示TPPU对sEH阳性细胞的静息膜电位及膜电阻无明显影响（图5 A-C）；而动作电位的发放频率，与对照组相比，加入TPPU后sEH阳性神经元动作电位的发放频率显著降低（图5 D-E）；进一步使用用相位图确定了动作电位的发放阈值，TPPU升高了sEH阳性神经元的动作电位的发放阈值（图5 F-G）；但TPPU对sEH阴性神经元这些电生理特性无明显影响（图5 H-N）。以上结果提示sEH的抑制剂TPPU会使CeA的sEH阳性神经元的兴奋性降低。

图6 病毒干扰CeA sEH表达使sEH阳性神经元的兴奋性降低

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了进一步明确sEH调控神经元兴奋性的机制。研究者采用立体定位微量注射的技术将sEH干扰腺病毒（AAV-CMV-eGFP-H1-Ephx2-shRNA）注射到Ephx2-tdTomato转基因小鼠的中央杏仁核两侧侧。待病毒表达21天后，膜片钳记录Ephx2-tdTomato阳性神经元与sEH干扰病毒共标的神经元的电生理特性。结果显示注射对照病毒和干扰病毒的两组小鼠CeA的sEH阳性神经元的静息膜电位及膜电阻无显著差异（图6 A-C）；与对照组相比，sEH干扰病毒使sEH阳性神经元动作电位的发放频率显著降低（图6 D-E）；进一步作者用相位图确定了动作电位的发放阈值，与对照组相比，sEH干扰病毒使sEH阳性神经元的动作电位的发放阈值显著增加（图6 F-G）。而来自两组小鼠的sEH阴性神经元的电生理特性无明显差异。以上结果表明sEH干扰病毒使中央杏仁核sEH阳性神经元兴奋性降低。

图7 11,12-EET使sEH阳性神经元的兴奋性降低

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

sEH是环氧花生四烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）的主要水解酶。ARA在CYP2J/2C的作用下生成EETs，sEH将一个水分子插入EETs的环氧基团生成相应的、低活性的DHETs。EETs有四个同分异构体：5,6-、8,9-、11,12-及14,15-EET。而已有研究表明11,12-EET可降低海马锥体神经元的兴奋性[8]。为了探索11,12-EET是否参与调控sEH阳性神经元的兴奋性，研究者采用全细胞膜片钳技术记录sEH阳性神经元在11,12-EET作用下其兴奋性的变化。结果显示11,12-EET对sEH阳性细胞的静息膜电位及膜电阻无明显影响（图7 A-C）；与对照组相比，加入11,12-EET后sEH阳性神经元动作电位的发放频率显著降低（图7 D-E）；进一步我们用相位图确定了动作电位的发放阈值，与对照组相比，加入11,12-EET后sEH阳性神经元的动作电位的发放阈值显著增加（图7 F-G）。综上，11,12-EET使中央杏仁核的sEH阳性神经元的兴奋性降低。

图8 sEH阳性神经元与焦虑样行为相关

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了探索CeA的sEH阳性神经元的活性是否与焦虑样行为相关。研究者采用立体定位微量注射的技术将神经元作为启动子并带有钙指示剂Gcamp的腺病毒rAAV-hsyn-DIO-Gcamp6s-WPRE-pA注射到Ephx2-tdTomato转基因小鼠的中央杏仁核一侧。小鼠经他莫昔芬（tamoxifen）诱导表达Cre重组酶表达后，可让中央杏仁核区域的sEH阳性神经元既表达红色荧光也可表达钙指示剂的绿色荧光（图8 A-B）。光纤记录系统结果发现在高架十字迷宫实验中，小鼠从闭臂进入开臂时中央杏仁核的sEH阳性神经元的钙活动显著增加（图8 C-D）。这些结果提示中央杏仁核的sEH阳性神经元可能参与焦虑样行为。

图9 化学遗传双向调控sEH阳性神经元活性可双向调控焦虑样行为

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了进一步探索CeA的sEH阳性神经元是否参与调控焦虑样行为。进一步运用化学遗传技术调控sEH阳性神经元。研究者采用立体定位微量注射技术将以神经元作为启动子的化学遗传激活病毒rAAV-hSyn-DIO-Hm3d(Gq)-mCherry-WPRE-pA 或化学遗传抑制病毒rAAV-hSyn-DIO-Hm4d(Gi)-mCherry-WPRE-pA注射到Ephx2-icreER^T2转基因小鼠两侧中央杏仁核区域。在启动子Ephx2和Syn的控制下，经他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后即可使激活病毒或抑制病毒和后面所带的mCherry表达在sEH阳性神经元上，与氯氮平结合后即可激活或抑制sEH阳性神经元（图9 A-D, I-J）。检测小鼠的焦虑样行为发现，在新环境进食压抑中发现，注射了激活病毒（hM3Dq）的小鼠，腹腔注射氯氮平后出现抗焦虑表型（9 E-H）；与之相反的是，注射了抑制病毒（hM4Di）的小鼠，腹腔注射氯氮平后表现出焦虑样行为（图9 K-N）。以上结果提示调控CeA的sEH阳性神经元的活性可双向调节焦虑样行为。

图10 sEH阳性神经元输出的3D重构图

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

图11 示踪sEH阳性神经元的下游投射脑区

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了探索sEH阳性神经元的环路机制，研究者采用病毒追踪方法示踪sEH阳性神经元的下游投射脑区，作者首先将AAV2/9-Ef1a-DIO-EYFP-WPRE-pA 病毒注射到Ephx2-iCreER^T2 小鼠的CeA双侧脑区，并用fMOST系统 成像。结果显示she阳性神经元主要投射到BNST（bed nucleus of the stria terminalis）和SNL（substantia nigra pars lateralis）脑区（图10）。为了进一步研究其下游投射，研究人员采用立体定位技术将顺行追踪病毒AAV2/9-hSyn-FLEx-mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby病毒注射于Ephx2-icreER^T2转基因小鼠的两侧CeA脑区（图11 A）。待病毒表达21天后，将小鼠灌注、冠状全脑冰冻切片，共聚焦观察发现顺行追踪病毒在CeA区域正常表达（图11 A），CeA阳性神经元主要投射于BNST和sNL（图11 B ，图12），而BNST是研究焦虑的重要脑区，因此作者主要研究sEH阳性神经元的CeA-BNST神经环路。

图12 sEH阳性神经元的下游投射脑区

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了研究sEH阳性神经元投射至BNST的主要神经元类型，作者将逆行病毒AAV2-Retro-Ef1a-DIO-EYFP 注射至 Ephx2-creER^T2 小鼠的 BNST脑区（图11 C），将逆标后的CeA脑片与CRF，SOM和PKCδ共标。结果显示47.2%的sEH阳性神经元与PKCδ共标 , 19.7% 与CRF共标，与SOM无共标（图11 D-G）。

图13光遗传调控sEH^CeA-BNST环路可双向调控焦虑样行为

（图源：Ren J, et al., J Neurosci, 2022）

为了探索sEH^CeA-BNST神经环路的功能机制，研究人员采用立体定位技术在Ephx2-icreER^T2鼠一侧CeA区域微量注射rAAV-EF1α-DIO-EYFP-WPRE-pA病毒 （EYFP对照组）或rAAV-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA病毒（ChR2组），在大脑同侧区域的BNST植入光纤（图13 A）；经他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后即可使光遗传激活病毒（ChR2）表达在sEH阳性神经元上并带有绿色荧光，在470 nm蓝光照射下即可激活从CeA投射至BNST的sEH阳性神经元（图13 B）；注射病毒6-8周后检测小鼠行为，高架十字迷宫实验发现，与对照组相比，给蓝光刺激，ChR2小鼠在开臂滞留时间显著增加；未给蓝光刺激时，两组小鼠在开臂滞留时间均无显著差异（图13 C-D）；在新环境压抑禁食实验和矿场实验中，光照下，对照组和ChR2小鼠行为均无显著差异（图13 F-G）。以上结果提示光遗传学激活sEH阳性神经元CeA-BNST环路，小鼠表现出抗焦虑样行为。

同样地，作者采用立体定位技术在Ephx2-icreER^T2鼠两侧CeA区域微量注射NpHR（AAV2/9-Ef1α-DIO-eNpHR3.0-mCherry-WPRE-pA）或mCherry对照病毒（AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry-WPRE-pA），在大脑两侧区域的BNST植入光纤（图13 H）；经他莫昔芬诱导cre重组酶表达后即可使光遗传抑制病毒（NpHR）表达在sEH阳性神经元上并带有红色荧光，在580 nm黄光照射下即可抑制从CeA投射至BNST的sEH阳性神经元（图13 I）；注射病毒6-8周后检测小鼠行为，新环境进食压抑实验中发现，与对照组相比，给黄光刺激，NpHR小鼠第一次去吃食物的时间（即潜伏期）显著增加；未给黄光刺激时，两组小鼠潜伏期均无显著差异（图13 K）；且两组小鼠的食欲是否给光都无显著差异（图13 L）；在高架十字迷宫实验和矿场实验中，光照下，对照组和NpHR小鼠行为均无显著差异（图13 M-N）。光遗传学抑制sEH阳性神经元CeA-BNST环路，小鼠表现出焦虑样行为。综上表明sEH^CeA-BNST神经环路在调控焦虑样行为中具有重要作用。

文章结论与讨论，启发与展望

该研究从分子、细胞、环路水平系统地研究了中央杏仁核（CeA ）的可溶性环氧化物水解酶（sEH）与焦虑样行为的关系，明确了sEH表达于CeA神经元；sEH分子及sEH阳性神经元参与调节焦虑样行为；并鉴定出sEH阳性神经元参与焦虑样行为的投射环路。此研究在CeA区域内发现新的焦虑样行为相关分子sEH，这为探寻新的抗焦虑药物靶点提供了新的可能性。以往的研究提示CeA中的神经元主要为GABA能抑制性中间神经元，具体可细分为：促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、生长激素抑制素（SOM）、蛋白激酶（PKCδ）三种阳性神经元，它们在焦虑、食欲、以及恐惧等相关行为中都有重要调节作用[9]。本文通过光纤记录系统、化学遗传技术和电生理技术，发现CEA的sEH阳性神经元参与焦虑样行为；提示CeA区域的sEH阳性神经元是调节焦虑样行为的新一类神经元。CeA的sEH阳性神经元是否能独立代表CeA区域新的一类功能神经元，与CRF、PKCδ三种阳性神经元有什么关系，需进一步去找寻更多证据阐明CeA的sEH阳性神经元与CRF、SOM、PKCδ阳性神经的同质性、异质性关系，几种神经元之间的环路连接以及相互功能调节机制。

此研究发现了焦虑症新的调控机制，为进一步研究CeA神经元在焦虑行为中的相互作用，及其介导的其他功能机制之间的相互关系和多行为表型的综合性疾病的机制研究奠定了基础，为sEH作为抗焦虑新靶标提供了科学依据；为研究焦虑症的新的分子、细胞和环路机制奠定了重要基础，为探寻抗焦虑药物靶点提供了新的方向和可能性。

原文链接： https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0281-21.2021

南方医科大学曹雄课题组成员，通讯作者曹雄教授（第1排左4），第一作者任静博士（第1排左3），共同第一作者卢成林博士（第1排左2）。

（照片提供自：曹雄课题组）

孙向东教授，广州医科大学，为该文共同通讯作者。

（照片提供自：孙向东课题组）

该文受到以下基金支持：

1． National Natural Science Foundation of China (31771187；81801293),

2． Guangzhou Science and Technology Project ( 201904020039, 202007030013)

3． Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province (2018B030334001, 2018B030340001),

4． The National Program for Support of Top-notch Young Professionals

5.    The Natural Science Foundation of Guangdong (2020B1515020006)

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制版︱王思珍

本文完