Mol Neurodegener︱胡风华课题组首次揭示颗粒蛋白前体衍生的颗粒蛋白的差异调节

撰文︱张婷婷

责编︱王思珍

颗粒蛋白前体（progranulin，PGRN）是由GRN基因编码的一种分泌型糖蛋白。PGRN的缺失与多种神经退行性疾病密切相关[1,2]。GRN基因突变导致的PGRN蛋白质水平降低已被证实是家族性额颞叶痴呆（frontal temporal lobar dementia，FTLD）的主要致病因素之一，其特征是在神经元中异常聚集RNA结合蛋白TDP-43 [3-5]。另外，GRN基因缺失也会引起神经元蜡样脂褐质沉着症（neuronal ceroid lipofuscinosis，NCL）[6,7]。NCL是一组儿童常见的遗传性进行性神经系统变性病。越来越多的证据表明PGRN在溶酶体中起着关键作用[8,9]。PGRN缺乏会促进溶酶体功能障碍。在分子和细胞水平上，PGRN定位于溶酶体[10]。PGRN与另外一种溶酶体蛋白prosaposin（PSAP)）相互作用，促进彼此的溶酶体运输[10-12]。在溶酶体中，PGRN 被蛋白酶水解后，生成7.5个高度保守的多肽片段，称为颗粒蛋白（granulin peptide），分别为Granulin A、B、C、D、E、F和G [13-15]。这些颗粒蛋白被认为具有独特的生物活性，其方式可能类似于来源于PSAP的saposin。与此一致，PGRN和颗粒蛋白肽已被证明可以调节多种溶酶体酶的活性，其中包括组织蛋白酶D（cathepsin D）[16-19] 和葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase）[20,21]。然而由于缺乏颗粒蛋白肽的特异性抗体，有关每个颗粒蛋白肽在溶酶体中的调节机制以及其蛋白水平的调节知之甚少。

2022年2月4日，美国康奈尔大学的胡风华课题组在Molecular Neurodegeneration上发表题为“Differential regulation of progranulin derived granulin peptides”的研究论文。作者通过构建针对每个颗粒蛋白肽的特异性抗体，分析每个颗粒蛋白肽在不同组织和不同脑区的分布与定位，发现单个颗粒蛋白肽的水平在生理和病理条件下受到不同的调节，为颗粒蛋白肽如何在溶酶体中发挥作用提供了新的见解。

为了研究每个颗粒蛋白肽的功能，作者首先构建了针对每个颗粒蛋白肽的特异性抗体。作者将纯化的GST-小鼠颗粒蛋白肽注射免疫实验兔子，收集抗血清，获得针对每个颗粒蛋白肽的多克隆抗体。为了验证抗体的特异性，作者过表达了GFP标记的每个颗粒蛋白肽，通过免疫印迹检测发现 除了颗粒蛋白B（Granulin B）抗体，其他Granulin A、C、D、E、F和Granulin G抗体均能够特异性识别各自的颗粒蛋白肽表达。其中GRN-B抗体可以识别Granulin B和少量Granulin C（图1 a）。此外，为了验证这些抗体能否特异性检测内源性蛋白，作者使用野生型（WT） 和GRN 基因敲除（Grn^-/-）小鼠 的肝脏组织，同样通过免疫印迹发现只有Granulin A、B、C、E和Granulin F可以特异性检测小鼠内源性颗粒蛋白肽（图1 b-c）。通过这些特异性的抗体检测，作者首先发现Granulin A、B、C、E和Granulin F在各个器官组织中的表达量有所不同（图1 b-c），提示即使它们来源于相同的颗粒蛋白前体PGRN，每个颗粒蛋白肽 在溶酶体中的产生或者其蛋白质稳定性可能不同。

图1 PGRN 和Granulin在不同组织的表达水平

（图源：Zhang et al., Mol Neurodegener, 2022）

PGRN含有5个糖基化位点，Granulin B、C和Granulin E各含有一个糖基化位点。此外，通过质谱分析对Granulin C和Granulin E中的糖基化位点进行了定位证实[22]。众所周知，糖基化修饰在蛋白质折叠、蛋白质稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用和信号转导中起着重要作用[23]。作者通过免疫沉淀以及通过多肽 N-糖苷酶（PNGase F）处理去除N-聚糖后，高分子量的蛋白条带变成迁移速度更快的一条较小分子量的条带，说明内源性的Granulin B,C和Granulin E是高度糖基化的蛋白（图2）。有趣的是，Granulin C的糖基化修饰形式在肝脏和脾脏中表现不同。相对于在肝脏，Granulin C在脾脏中观察到高度糖基化形式的水平有所增加。

图2 GranulinC和Granulin E具有高度糖基化修饰

（图源：Zhang et al., Mol Neurodegener, 2022）

为了研究颗粒蛋白肽在神经系统中的功能，作者检测了每个颗粒蛋白肽以及PGRN在不同神经细胞以及在不同脑区的衍生和分布，发现PGRN和颗粒蛋白肽的水平在不同的大脑区域有所不同，在成年雄性小鼠皮质区颗粒蛋白肽和PGRN之间的比率最高（图3）。然而在雌性小鼠中无法得到一致的结论。作者推测雌性小鼠中PGRN和Granulin可能受到雌激素水平调节[24-27]。该研究可进一步在小鼠动情周期的不同阶段检测PGRN和Granulin的水平以及Granulin/PGRN比率，观察雌激素和其他激素的波动对PGRN水平和切割加工的影响。

图3 PGRN 和Granulin在不同脑区的表达水平

（图源：Zhang et al., Mol Neurodegener, 2022） 

在中枢神经系统PGRN在神经元和小胶质细胞中高度表达。病理条件下，活化的小胶质细胞中的PGRN的表达水平异常增高[8]。为了研究PGRN衍生的颗粒蛋白肽在神经系统中的细胞定位以及蛋白水平的调节，作者通过优化免疫荧光染色观察到Granulin-A 定位于神经元和小胶质细胞的溶酶体中（图4 a）。接下来，作者通过两种不同的小鼠病理模型，Rose Bengal 诱导的脑缺血和 Cuprizone 诱导的脱髓鞘病变。作者一致的发现，在这两种病理条件下，小胶质细胞激活并且PGRN在小胶质细胞中的水平均增高。有趣的是，Granulin A在小胶质细胞中的水平增加与PGRN有所不同。如脑缺血后，Granulin A的增高水平与PGRN类似，然后在脱髓鞘小鼠模型中， PGRN的水平高于Granulin A三倍（图4 b-g）。以上结果提示：Granulin-A在小胶质细胞中可能具有异于PGRN的独特的生物学功能。因此Granulin A特异性抗体不仅可应用于免疫印迹，也可用于免疫荧光染色。

图4 Granulin A在神经元和小胶质细胞的溶酶体中表达

（图源：Zhang et al., Mol Neurodegener, 2022）

课题组前期研究发现溶酶体蛋白酶，如组织蛋白酶（cathepsins）在PGRN加工中发挥作用。组织蛋白酶L（cathepsins L）在体外能有效地将PGRN水解切割成颗粒蛋白[13-15]。然而溶酶体蛋白酶如何在体内调节PGRN切割仍不清楚。作者通过使用特异性的抗体，分别检测了多种组织蛋白酶缺失的小鼠中皮质区的PGRN切割，如组织蛋白酶B、D、 L、K和 Z。通过免疫印迹定量分析敲除小鼠皮质中每个颗粒蛋白肽和PGRN之间的比率以及每个颗粒蛋白肽的表达水平，作者发现组织蛋白酶B的缺失（Ctsb^-/-）仅仅导致Granulin A和Granulin B水平增高，而Granulin C和Granulin F没有改变（图5 a），提示组织蛋白酶B可能参与调节Granulin A和Granulin B在溶酶体中的产生或者其蛋白稳定性。作者还发现当组织蛋白酶D缺失（Ctsd^-/-）时，Granulin A，B和Granulin C水平增高，而仅Granulin F没有改变（图5 b）。与体外实验不同的是，组织蛋白酶L单独缺失（Ctsl^-/-）或者组织蛋白酶B和组织蛋白酶L同时缺失（Ctsb^-/-Ctsl^-/-）时，颗粒蛋白肽和PGRN之间的比率均没有改变（图5 c-d），提示组织蛋白酶B或者L可能都不是体内调节PGRN切割的关键酶。这些结果（图5）提示：PGRN的体内切割调节过程复杂，当一种或两种组织蛋白酶缺失时，其他的组织蛋白酶可能发挥代偿作用，参与PGRN的切割或者参与单个或多个特异的颗粒蛋白肽切割。

图5 不同组织蛋白酶的缺失对PGRN和Granulin的影响

（图源：Zhang et al., Mol Neurodegener, 2022）

此外，作者观察到当组织蛋白酶D缺失（Ctsd^-/-） 时，Granulin C的糖基化修饰形式被改变，如较高分子量的蛋白水平明显增加（图5 b）。相似的是，当组织蛋白酶B和组织蛋白酶L同时缺失（Ctsb^-/-Ctsl^-/-） 时，Granulin C的糖基化修饰形式被改变（图5 c-d）。有报道称组织蛋白酶D单独缺失或者组织蛋白酶B和组织蛋白酶L同时缺失时，小鼠表现出非常明显的溶酶体功能异常[27,28]。因此作者推测Granulin C的糖基化修饰形式可能由于溶酶体功能障碍时导致的溶酶体糖苷酶活性的变化所致。然而Granulin B的糖基化修饰没有发生改变，再次提示Granulin B和Granulin C的糖基化修饰在生理和病理条件下受到不同的调节。

PGRN与另外一种溶酶体蛋白prosaposin（PSAP）相互作用，形成复合物并可促进彼此的溶酶体运输[15]。PGRN和PSAP具有很多相似之处。在溶酶体中，PGRN和PSAP分别进行切割产生单个Granulin [13-15] 和saposin [29]。然而，PGRN 和PSAP的相互作用是否影响彼此的切割尚未可知。作者检测了PSAP缺失小鼠（Psap^-/-）的皮质区中的PGRN切割以及单个颗粒蛋白肽的蛋白水平。由于PSAP缺失小鼠（Psap^-/-）导致PGRN的溶酶体运输障碍，PGRN的切割（GRNs/PGRN）整体减少（图6），生成的Granulin A,B和Granulin C均减少，反之，Granulin F与全长PGRN的比例没有减少。作者通过比较Granulin B,C,F和Granulin A的改变水平，得出PSAP缺失时Granulin C,F与Granulin A,B存在显著差异调节（图6）。此外，PSAP缺失（Psap^-/-）时，Granulin B和Granulin C的较高分子量的蛋白糖基化水平明显升高，再次提示Granulin B和Granulin C的糖基化在病理条件下受到不同调节，很有可能是由于PSAP缺失导致的溶酶体功能异常。

图6 PSAP的缺失对PGRN和Granulin的调节

（图源：Zhang et al., Mol Neurodegener, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述， 该研究通过构建获得针对单个颗粒蛋白肽（Granulin）的特异性多克隆抗体，作者发现与不同组织中的Granulin A 和B相比，Granulin C、E和F的水平受到不同的调节。PGRN和Granulin的水平在不同的大脑区域有所不同，并且Granulin和全长PGRN之间的比率在成年雄性小鼠大脑的皮质区中最高。通过优化后的免疫荧光染色，作者发现Granulin A在神经元和小胶质细胞的溶酶体中表达，并且在病理条件下其在小胶质细胞中的水平增加。有趣的是，小胶质细胞中的Granulin A水平在脑缺血情况下随着PGRN的表达升高而同比例升高，但是在脱髓鞘病变下，与PGRN相比，Granulin A水平没有相应升高。此外，作者发现溶酶体中组织蛋白酶 （如组织蛋白酶B、D、K、L及Z）和 PGRN 结合伴侣 PSAP的缺乏均会导致单个颗粒蛋白肽之间的比例发生变化。同时，该研究也证明了Granulin B、C 和 E 是高度糖基化的蛋白，且糖基化修饰形式可受到不同调节。因此，该研究首次揭示单个颗粒蛋白肽的水平在生理和病理条件下受到不同的调节，并为颗粒蛋白肽如何在溶酶体中发挥作用提供了新的见解。

PGRN和PSAP具有很多相似之处。研究报道，单个saposin在溶酶体中的调节有所不同。例如，saposin A和D是许多溶酶体贮积症[30] 中发现的脂褐素的主要成分，这表明saposin A和D在溶酶体中具有不同于saposin B和C的生化特性，尽管它们来源于同一个前体蛋白。作者推测每个Granulin可能也具有独特的生物学功能。目前该研究尚未分析每个Granulin 受到不同调节的原因，各自的蛋白质稳定性，糖基化的修饰调节等，还需要进一步的实验证明。

额颞叶痴呆（FTLD）中的PGRN不足可同时导致单个颗粒蛋白肽的水平降低[12]，因此这些特异性抗体的获得以及应用已迈出重要一步。作者通过了解单个颗粒蛋白的水平是如何调节的, 这也对研究FTLD的病理机制以及治疗策略起到启发作用。

原文链接：https://molecularneurodegeneration.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13024-021-00513-9

  实验室合照：第一作者张婷婷（前排右三），通讯作者胡风华（后排右一）

（照片提供自胡风华实验室）

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制版︱王思珍

本文完