PNAS︱周健等人揭示Rett综合征及相关神经发育疾病的共同分子机制
撰文︱周 健
责编︱王思珍
全世界大约有3-5%的儿童患有某种形式的神经发育障碍。这类神经性疾病具有很多重叠的特征，最常见的是自闭症、智力障碍、运动失调，以及癫痫。其中，Rett综合征（Rett syndrome，RTT ）和MECP2重复综合征（MECP2 duplication syndrome，MDS）是分别由MECP2基因功能丧失突变和重复突变引起的神经发育疾病，并影响认知、运动、情绪和多器官系统功能[1, 2]。然而，MECP2基因的突变驱动疾病的确切分子机制仍不清楚。
携带Mecp2基因突变的小鼠疾病模型忠实的再现了患者的神经行为学表型，因而是研究RTT和MDS疾病非常有用的工具。通过对小鼠模型的转录组学分析揭示了数千个基因表达水平的变化，表明MeCP2的功能障碍广泛影响基因的表达。鉴于MeCP2蛋白不含有转录激活或酶促结构域，一般认为MeCP2蛋白通过其甲基结合结构域（MBD）结合DNA，并通过转录抑制结构域（TRD）募集其他转录调控因子，例如NCoR1/2转录抑制复合物中的组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）亚基来抑制基因转录[3]。MeCP2的TRD中引起RTT的突变破坏了MeCP2与NCoR1/2复合物的结合，表明这种蛋白相互作用在RTT发病机制中起关键作用[3]。然而，在病人和小鼠模型中，TRD中的几个突变尽管完全破坏了MeCP2和NCoR1/2复合物之间的相互作用，其导致的疾病症状与MBD中的突变相比却较为温和[4–8]。此外，在小鼠中NCoR1/2复合物中HDAC3的失活并不能减轻由MeCP2过表达引起的缺陷[9]。这些结果说明NCoR1/2复合物并不是唯一重要的MeCP2结合蛋白，因而可能存在其他MeCP2相互作用因子介导其分子功能和发病机制。
2022年1月25日，美国德克萨斯州贝勒医学院Jan and Dan Duncan神经研究所的Huda Zoghbi课题组在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为“Disruption of MeCP2–TCF20 complex underlies distinct neurodevelopmental disorders”的研究论文。周健博士为论文第一作者，Huda Zoghbi教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者确定了大脑中与MeCP2相互作用的一个全新的转录因子20（TCF20） 复合物。通过生化、神经生物学、动物行为学和转录研究分析，作者发现TCF20复合物在MeCP2依赖的基因调控中起着直接作用，并共同引发突触和行为缺陷。该研究揭示了MeCP2一个未知的分子生物学功能，并表明MeCP2-TCF20复合物的形成对大脑正常功能起到关键作用。
为了识别新的MeCP2相互作用蛋白，作者在体外培养的成熟大鼠原代神经元中进行了邻近生物素鉴定和质谱分析（BioID-MS）。该方法可以识别生理条件下相邻蛋白质之间高度特异的相互作用。为了寻找MeCP2在结合染色质环境下的相互作用蛋白，作者使用了两个等位基因突变体作为阴性对照：1）MECP2-R111G，破坏了MeCP2与DNA结合的能力；2）MECP2-ΔNLS，破坏了MeCP2的核定位（图1 A）。该方法确定了五种候选蛋白质（图1 B），其中的两种蛋白（TCF20和PHF14）与另外两种蛋白质（RAI1和HMG20A）相互结合形成了一种稳定的新复合物（图1 C, D），作者称之为TCF20复合物。有趣的是，编辑TCF20复合物中的多个亚基的基因突变体都会导致神经发育疾病，其中TCF20的突变会导致一种TCF20相关的神经发育障碍（TAND）[10–12]，RAI1的突变会引起Smith–Magenis综合症（SMS）[13]，而PHF14的突变也会引起一种新的神经发育障碍（见后文）。这些生化及遗传学的数据说明该复合物可能对大脑的正常发育有着重要的作用。
图1 MeCP2 在体外和体内与 TCF20 复合物相互作用
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
随后的一系列包括免疫共沉淀（co-IP）在内的细胞及生化实验进一步证实了MeCP2与TCF20复合物在小鼠大脑中的相互作用（图1 E, F）。在缺乏PHF14的细胞中，MECP2和TCF20不能再形成这种复合物（图1 G），说明MeCP2通过PHF14与TCF20复合物结合。值得注意的是，MeCP2蛋白中引起疾病的突变会干扰其与TCF20复合物的相互作用（图2），说明MeCP2-TCF20复合物的相互作用可能与RTT发病机制相关。
图2 MBD中引起RTT的突变破坏了MeCP2与TCF20复合物的相互作用
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
确定MeCP2和TCF20复合物的相互作用之后，作者接下来探究这些蛋白质之间是否存在功能上的关联。对小鼠脑细胞的分析表明，Mecp2与Tcf20高度共表达（图3 A-C）。在体外培养的小鼠神经元中，降低TCF20的水平会减少脑源性神经营养因子（BDNF）的表达（图3 E, F）。BDNF是一种已知的促进突触形成的信号分子，其表达同时也受到MeCP2的影响。基于这些数据，进一步的研究发现，降低TCF20水平可以挽救因MECP2基因过度活跃导致的过量突触形成（图3 D），结果支持了TCF20和MeCP2共同调节编码BDNF的基因的活性并最终调节突触形成的假说。
图3 Tcf20在小鼠神经元中与Mecp2共表达并调节MECP2介导的突触生成
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
为了更好地了解TCF20蛋白在体内的作用，研究人员构建了Tcf20单倍剂量不足小鼠（图4 A-C）（完全消除TCF20 会导致小鼠在出生后不久死亡）。通过一系列病理和行为测试，他们表明这些Tcf20缺陷小鼠再现了TAND病人的表型，并表现出Rett综合征小鼠模型中常见的特征——例如，异常缺乏焦虑反应、以及记忆和学习缺陷（图4 D-H）。两种小鼠模型之间神经行为缺陷的部分重叠表明TCF20和MeCP2可能共享下游神经转录通路。
图5 MeCP2和TCF20共享共同的下游神经元基因和通路
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
对大脑组织的转录学分析表明，在TCF20和MeCP2突变小鼠中，基因表达确实存在相似的变化（图5 A, B），并在重要的神经通路中富集（图5 C）。降低TCF20的水平可以挽救MeCP2过表达（MDS）小鼠模型中的某些行为缺陷（图6）。这些结果支持TCF20和MeCP2共同调节神经元基因和通路的表达的观点。
图6 降低TCF20的水平可以挽救MDS小鼠的行为缺陷
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
MECP2和TCF20的基因突变都会引起特定的神经发育疾病（分别为RTT和TAND）。鉴于PHF14介导了MeCP2和TCF20复合物之间的相互作用，PHF14中的突变有可能也会引起神经发育疾病。为了测试这一假设，作者随后对人类基因组和临床数据进行了分析，发现了两名有类似于RTT症状的患者在编码PHF14的基因中发生了突变（图7 A, B）。进一步的分子与生化实验表明，其中一个PHF14基因的点突变，即PHF14 C322G，破坏了PHF14介导的MeCP2与TCF20复合物的相互作用（图7 C, D），说明MeCP2-PHF14-TCF20复合物的形成与功能可能对大脑的正常发育至关重要。
图7 与产生类似于RTT的神经发育症状有关的PHF14突变破坏了MeCP2和TCF20复合物的相互作用
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
图8 工作总结图：MeCP2和TCF20复合物相互作用的机制
（图源：J. Zhou, et al., PNAS, 2022）
全世界约有3-5%的儿童患有某种类型的神经发育障碍，其中许多患者都有共同的症状。虽然大规模测序和生物信息学方法使我们发现了其中一些疾病背后的基因突变，但将蛋白质相互作用分析与疾病模型中的基因组/遗传学研究相结合的组合方法对于了解这些疾病的发病机制仍然至关重要。TCF20复合物的发现及其与MeCP2的相互作用加深了我们对一系列神经发育疾病包括Rett综合征（RTT）、MECP2重复综合征（MDS）、TCF20相关的神经发育障碍（TAND）及其Smith–Magenis综合症（SMS）的发病机理的认识，并突出了一些驱动其共同症状的分子变化。
越来越多的证据表明，MeCP2募集多种蛋白质复合物来发挥其功能。除了TCF20复合物外，许多与MeCP2相互作用的染色质蛋白，例如SIN3A和NCoR1/2复合物的几个成分，也与神经发育表型相关[14–16]。这些数据表明，以 MeCP2 为中心的蛋白质相互作用网络的成员可能会影响更广泛的疾病群。
有趣的是，尽管在缺乏其他已知致病突变的神经发育障碍患者中发现了新的PHF14突变体，本研究并没有观察到Phf14杂合小鼠有显著的行为异常或基因转录变化。同时，健康的个体也发现有PHF14的突变，这表明PHF14单倍体不足的影响可能具有低外显率或在晚年发病。因此，作者仍然对PHF14变异的致病性持保留态度。在今后的研究中鉴定更多具有PHF14突变的患者可以更好地评估其基因型-表型关系，并进一步确认PHF14基因的突变对于神经发育疾病表型的影响。
总之，研究提示MeCP2通过与大脑中的其他几种蛋白质形成复合物，有助于调节神经元之间的突触连接与神经功能相关的基因表达（图8）。这些发现为Rett综合征以及一系列TCF20复合物相关突变引起的神经发育疾病的发病机制提供了新的见解。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2119078119
（照片提供自：Huda Zoghbi实验室）
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1. R. E. Amir, et al., Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl- CpG-binding protein 2. Nat. Genet. 23, 185–188 (1999).
2. H. Van Esch, et al., Duplication of the MECP2 region is a frequent cause of severe mental retardation and progressive neurological symptoms in males. Am. J. Hum. Genet. 77, 442–453 (2005).
3. M. J. Lyst, et al., Rett syndrome mutations abolish the interaction of MeCP2 with the NCoR/SMRT co-repressor. Nat. Neurosci. 16, 898–902 (2013).
4. J. L. Neul, et al., Specific mutations in Methyl-CpG-Binding Protein 2 confer different severity in Rett syndrome. Neurology 70, 1313–1321 (2008).
5. V. A. Cuddapah, et al., Methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) mutation type is associated with disease severity in rett syndrome. J. Med. Genet. 51, 152–158 (2014).
6. S. A. Baker, et al., An AT-hook domain in MeCP2 determines the clinical course of Rett syndrome and related disorders. Cell 152, 984–996 (2013).
7. L. D. Heckman, M. H. Chahrour, H. Y. Zoghbi, Rett-causing mutations reveal two domains critical for MeCP2 function and for toxicity in MECP2 duplication syndrome mice. Elife 3, 1–17 (2014).
8. K. Brown, et al., The molecular basis of variable phenotypic severity among common missense mutations causing Rett syndrome. Hum. Mol. Genet. 25, 558–570 (2016).
9. M. V. Koerner, et al., Toxicity of overexpressed MeCP2 is independent of HDAC3 activity. Genes Dev. 32, 1514–1524 (2018).
10. C. Babbs, et al., De novo and rare inherited mutations implicate the transcriptional coregulator TCF20/SPBP in autism spectrum disorder. J. Med. Genet. 51, 737–747 (2014).
11. F. Vetrini, et al., De novo and inherited TCF20 pathogenic variants are associated with intellectual disability, dysmorphic features, hypotonia, and neurological impairments with similarities to Smith-Magenis syndrome. Genome Med. 11, 12 (2019).
12. E. Torti, et al., Variants in TCF20 in neurodevelopmental disability: description of 27 new patients and review of literature. Genet. Med. 21, 2036–2042 (2019).
13. R. E. Slager, T. L. Newton, C. N. Vlangos, B. Finucane, S. H. Elsea, Mutations in RAI1 associated with Smith-Magenis syndrome. Nat. Genet. 33, 466–468 (2003).
14. M. Zaghlula, et al., Current clinical evidence does not support a link between TBL1XR1 and Rett syndrome: Description of one patient with Rett features and a novel mutation in TBL1XR1, and a review of TBL1XR1 phenotypes. Am. J. Med. Genet. Part A 176, 1683–1687 (2018).
15. W. Zhou, et al., Loss of function of NCOR1 and NCOR2 impairs memory through a novel GABAergic hypothalamus–CA3 projection. Nat. Neurosci. 22, 205–217 (2019).
16. J. S. Witteveen, et al., Haploinsufficiency of MeCP2-interacting transcriptional co-repressor SIN3A causes mild intellectual disability by affecting the development of cortical integrity. Nat. Genet. 48, 877–887 (2016).
制版︱王思珍
本文完