J Neuroinflammation︱章京课题组揭示帕金森病患者单核细胞免疫超活化新机制：携带α-syn红细胞来源胞外囊泡
撰文︱章京，杨迎，王健
责编︱王思珍
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是人类第二大常见的神经退行性疾病，仅次于阿尔兹海默病。其主要临床表现包括静止性震颤、运动迟缓、肌肉强直和姿势平衡障碍。主要病理特点包括黑质多巴胺能神经元丢失及神经元胞浆内存在大量蛋白聚集形成的路易氏体。α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）是路易氏体的主要成分之一，它不仅存在于中枢神经系统中，而且也广泛存在于血液中，特别是在红细胞（RBCs）中[1]。此前，已有文章证明红细胞能够分泌含α-syn的细胞外囊泡（EVs），这些红细胞衍生的EVs（RBC- EVs）可以穿过血脑屏障，在星形胶质细胞和小胶质细胞中沉积α-syn，导致星形细胞功能障碍和小胶质细胞激活[2, 3]。除了运动和非运动功能障碍、多巴胺神经元缺失外，中枢神经系统炎症是PD发病的显著特征。有报道称在PD中小胶质细胞活化伴随炎症细胞因子增加和免疫细胞浸润[4, 5]。除了中枢炎症，PD患者也存在外周炎症。PD患者的外周炎症主要表现为循环系统内炎性因子异常升高，外周免疫细胞免疫超活化[6]。尽管PD外周炎症已经被广泛证实，但目前有关PD患者外周炎症的研究仍处于探索阶段。考虑到外周炎症会促使PD病理进展，探索PD外周炎症的分子机制对PD的诊断、治疗都有非常重要的意义。
2022年2月22日，浙江大学医学院附属第一医院的章京教授团队在Journal of Neuroinflammation上发表了题为“α-Synuclein-containing erythrocytic extracellular vesicles: essential contributors to hyperactivation of monocytes in Parkinson’s disease”的文章，阐述了外周RBC-EVs携带的病理性的寡聚的α-syn可导致循环系统里的单核细胞免疫超活化，这一过程需要受体介导的内吞作用和LRRK2激活。
该研究首先检测了PD患者外周单核细胞免疫超活化的程度。用脂多糖（LPS）刺激外周单核细胞24小时，通过qPCR和超敏多因子电化学免疫发光检测平台（MSD）的炎性因子检测试剂盒检测发现，PD患者外周单核细胞在受到LPS刺激后炎性因子mRNA水平显著高于健康对照组（图1 B），除了IFN-γ、IL-12p70、IL-8，其他炎性因子在PD患者的单核细胞培养上清液中的浓度显著高于健康对照组（图1 C, D）。综上所述，相较于健康对照，PD患者外周循环单核细胞在受到外来刺激时会产生更多的炎性因子，呈现免疫超活化状态。 为了进一步探索PD患者外周单核细胞免疫超活化的机制，作者引入外周过表达A53T突变型α-syn的模型小鼠（后文简称A53T小鼠），并评价了A53T小鼠外周单核细胞超活化情况。结果发现，相较于对照组（WT组），A53T小鼠外周单核细胞在受到LPS刺激后产生的炎性因子显著增加（图1 E-G），同样呈现免疫超活化状态。
图1PD患者与A53T小鼠外周单核细胞免疫超活化
（图源：Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
先前的研究发现含有α-syn的RBC-EVs能够穿过血脑屏障并激活小胶质细胞[3]。考虑到外周循环系统内的单核细胞直接暴露在富含RBC-EVs的环境中，因此，作者推测PD外周单核细胞的免疫超活化现象可能是由RBC-EVs来源的α-syn引起的。为此，作者采用Western blot、纳米粒子跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜[7]对RBC-EVs进行表征。结果表明，在WT小鼠、PD模型小鼠以及SNCA-KO小鼠之间RBC-EVs的粒径分布无显著区别（图2 A-C）；相较于WT小鼠与SNCA-KO小鼠来源的RBC-EVs，PD小鼠来源的RBC-EVs携带有更多的不同形式的α-syn（图D-E）。
图2 小鼠来源RBC-EVs表征
（图源：Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
为了探索携带α-syn的RBC-EVs在免疫超活化中的作用，作者选择THP-1细胞系作为单核细胞模型，用不同来源的RBC-EVs预处理THP-1细胞24小时，随后加入LPS刺激THP-1细胞产生免疫反应，通过qPCR以及MSD检测THP-1细胞炎性因子生成情况。结果显示，用A53T RBC-EVs预处理THP-1细胞后，LPS刺激其炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平显著高于WT RBC-EVs细胞（图3 A），产生的炎性因子浓度显著高于未处理的THP-1细胞与WT RBC-EVs处理的THP-1细胞（图3 B）。这些结果表明：相比于WT小鼠，A53T小鼠的RBC-EVs能够对THP-1单核细胞产生显著的免疫超活化作用。
图3 携带α-syn的A53T小鼠来源RBC-EVs引起THP-1细胞免疫超活化。
（图源：Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
由于A53T小鼠是在外周过表达A53T突变型α-syn所构建的动物模型，相较于WT小鼠的RBC-EVs，A53T小鼠来源的RBC-EVs携带有更多的α-syn。因此，作者推测：α-syn可能参与了A53T小鼠外周单核细胞的免疫超活化过程。作者选择不同浓度的寡聚体形式的α-syn预处理THP-1细胞并检测其在接受LPS刺激后炎性因子生成的变化。结果发现：寡聚体形式α-syn处理后的THP-1呈现出显著免疫超活化状态，且随浓度增加，免疫超活化效果也逐渐增加，表现为炎性因子生成显著增加（图4）。
图4 寡聚α-syn引起THP-1细胞免疫超活化。
（图源： Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
为了进一步探索RBC-EVs引起单核细胞免疫超活化的机制，作者采用四种不同类型的内吞抑制剂阻止RBC-EVs进入单核细胞以研究单核细胞的免疫超活化情况。结果发现，其中两种抑制剂，即Me-β-CD、Nocodazole，可以显著降低由A53T RBC-EVs引起的免疫超活化情况。因此，作者证明：RBC-EVs对单核细胞的免疫超活化作用依赖于RBC-EVs进入单核细胞，通过抑制单核细胞对RBC-EVs的细胞内吞，可以缓解单核细胞的免疫超活化（图5）。
图5 内吞作用参与A53T RBC-EVs诱导的单核细胞免疫超活化
（图源： Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
此前有文章发现富亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）在PD患者的免疫异常反应中起着非常重要的作用。因此，作者接下来研究了RBC-EVs引起的单核细胞免疫超活化是否与LRRK2有关。由图6 A-B所示，A53T小鼠外周单核细胞中LRRK2蛋白水平显著高于WT小鼠，同时A53T小鼠外周单核细胞中Rab10磷酸化程度也显著高于WT小鼠。Rab10作为LRRK2激酶的底物，其磷酸化程度直接反应LRRK2激酶活性。以上实验说明LRRK2激酶活性在A53T小鼠的单核细胞内也有所增加。随后，作者分别用WT RBC-EVs与A53T RBC-EVs刺激THP-1细胞。由图6 C-F可以发现，在A53T RBC-EVs刺激下，THP-1细胞内LRRK2蛋白水平及其激酶活性显著增加，而WT RBC-EVs相较于空白组并未有显著变化。随后作者采用LRRK2激酶抑制剂MLi2对A53T RBC-EVs刺激的THP-1细胞进行处理，并采用qPCR以及MSD的方法检测THP-1细胞内能够反应细胞超活化状态的炎性因子生成情况。如图6 H-I，在MLi2处理后，THP-1细胞内炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平显著降低，细胞培养上清液中炎性因子IFN-γ, IL-13, IL-12p70, IL-10, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 与TNF-α也显著低于单独A53T RBC-EVs处理组。以上实验说明：在A53T小鼠的RBC-EVs刺激下，THP-1细胞的LRRK2蛋白水平及其激酶活性增加，通过抑制LRRK2激酶活性，可以显著降低A53T RBC-EVs引起的THP-1细胞免疫超活化。由此，作者明确LRRK2参与了RBC-EVs引起的单核细胞免疫超活化。
图6 A53T RBC-EVs引起单核细胞内LRRK2增加。
（图源： Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
为了进一步探索RBC-EVs对于单核细胞的超活化作用在PD患者中的重要性，作者采用PD患者以及健康对照（HC）的RBC-EVs对上述结果进行验证。通过western blot、NTA、TEM对提取的RBC-EVs进行表征（图7 A-C）。MSD结果显示，PD患者的RBC-EVs中α-syn以及寡聚体形式的α-syn高于HC RBC-EVs（图7 D-E）。作者用PD RBC-EVs与HC RBC-EVs刺激THP-1细胞，并检测其LRRK2蛋白水平及其激酶活性变化情况。结果如图6 F-H：相较于空白组，HC RBC-EVs刺激与PD RBC-EVs刺激后，THP-1细胞内LRRK2蛋白含量均显著增加。同时，PD RBC-EVs引起LRRK2激酶活性显著增加（Rab10蛋白磷酸化程度增加），以上结果与动物来源RBC-EVs的结果一致。
图7 PD患者的 RBC-EVs引起单核细胞免疫超活化
（图源： Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
最后，作者采用qPCR以及MSD的方法评价PD RBC-EVs与HC RBC-EVs刺激单核细胞后引起的免疫超活化程度。结果如图8，PD RBC-EVs处理的单核细胞在接受LPS刺激后，相较于空白对照组以及HC RBC-EVs处理组，细胞内炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平显著增加，细胞分泌炎性因子显著增加。结果进一步证明了携带有α-syn的RBC-EVs通过激活LRRK2分子从而引起单核细胞免疫超活化的过程。
图8 PD患者RBC-EVs诱导单核细胞免疫超活化。
（图源： Liu Z, et al., J Neuroinflammation, 2022）
总之，该团队的研究结果表明，外周RBC-EVs携带的病理性的寡聚的α-syn可导致循环系统里的单核细胞免疫超活化，这一过程需要受体介导的内吞作用和LRRK2激活。此研究为散发性PD的免疫失调提供了一个新的视角，并强调了外周血单核细胞内的LRRK2抑制可作为改善PD发病机制的潜在治疗靶点。
原文链接：https://doi.org/10.1186/s12974-022-02413-1
通讯作者：章京（前排右三）、杨迎（前排右二）。
（照片提供自浙江大学医学院附属第一医院章京课题组）
浙江大学医学院附属第一医院章京教授和杨迎特聘副研究员为本文的通讯作者，博士研究生刘宗然为本文的第一作者。本研究得到了国家重点研发计划重大慢性非传染疾病防控研究、国家自然科学基金、中国博士后科学基金的资助。
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【3】多模态磁共振脑网络分析入门班（线上：2022.4.6~4.16）
【4】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会 （2022.4.2-3 腾讯在线会议）
参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完