STAR Protocols︱巫凌刚团队提出新型实时可视化方案观测活细胞内胞吞胞吐的膜动态变化

Original 韩素娥逻辑神经科学 2023-03-10

收录于合集

撰文︱韩素娥

责编︱王思珍

编辑︱查佳雪

胞吞作用（endocytosis）是指细胞通过质膜内陷来包裹质膜上的物质或者胞外物质，并将其转运到细胞内部的过程。在胞吞过程中，细胞膜会内陷、发生形变，最终形成球形囊泡，从质膜上分离脱落下来进入细胞浆。相反，胞吐作用（exocytosis）是指细胞内囊泡与细胞膜融合，在融合蛋白的帮助下，将细胞内的物质释放到细胞外的过程。作为细胞的基本生理功能，胞吞和胞吐在多种生物学活动如物质吸收与分泌、神经递质传递、病毒感染、细胞受体与配体的转运等过程中发挥着至关重要的作用[1]。胞吐涉及到膜融合（membrane fusion）和融合孔（fusion pore）的开放，而胞吞涉及到膜分离（membrane fission），胞吞与扁平的细胞膜转变为椭圆或圆形的囊泡过程有关。胞吞和胞吐是细胞生命活动中不可或缺的组成部分，二者时刻处在一种高度动态的平衡之中。

在胞吞和胞吐过程中，膜动态（membrane dynamics）及其调控过程一直是领域内密切关注的问题。传统的研究方法通常采用单一的电容记录，或者电子显微镜成像，间接推测细胞膜及融合孔的动态变化过程[2-4]。然而，正所谓眼见为实，以往的方法无法将胞吞胞吐的动态过程进行实时可视化成像。无法亲眼看到膜动态过程，是深入研究多种胞吞模式、融合模式等膜动态及其调控机制的关键难点。尽管很多理论已被广泛提出和接受，但由于技术原因，这些理论过程仍然未曾通过成像系统在活细胞中实时观测到，因此尚未得到直接的证据证实。

近期，美国国立卫生研究院（NIH）巫凌刚教授团队在Cell旗下的STAR Protocols杂志在线发表了题为“Real-time visualization of exo- and endocytosis membrane dynamics with confocal and super-resolution microscopy”的研究方案论文，介绍了采用激光共聚焦和超高分辨率STED显微镜对活细胞的胞吞和胞吐过程进行实时可视化监测的方法。团队的郭小黎（Xiaoli Guo）和韩素娥（Sue Han）为论文共同第一作者。巫凌刚研究团队使用该方案研究胞吞和胞吐作用，直接观测到了细胞膜动态变化。团队研究人员观察并证实了半融合中间体结构的存在，发现了融合孔动态调控机制，并且观察到扁平膜通过∧形、Ω形质膜转变为圆形囊泡的过程，从而建立了一系列崭新的膜转化理论。系列研究工作已发表于期刊Nature、Cell、Neuron[5-7]等国际高水平杂志。

此方案详细介绍了实时观测活细胞膜动态的实验步骤，包括全细胞膜片钳记录、激光共聚焦显微镜、超高分辨率受激发射损耗（STED）显微镜、电镜等技术。研究人员采用牛的活细胞（位于肾上腺髓质内的嗜铬细胞）作为研究对象，首先介绍了培养高质量神经内分泌细胞的详细步骤（图1）。相比于神经元，神经内分泌细胞囊泡较大（300 nm-600 nm），大于STED显微镜分辨率（60 nm），因此能够得到更高的成像信噪比，更易于进行实时成像观察。

图1 神经内分泌嗜铬细胞的原代培养