Nat Commun︱全舒/薛毅/吴斌团队合作揭示分子伴侣如何不消耗能量而释放底物的机制

撰文︱何   为

责编︱王思珍

编辑︱杨甜甜

衰老以及多种神经退行性疾病中均存在蛋白质稳态失衡问题。分子伴侣是维持体内蛋白质稳态平衡的关键因子，其在促进新生态链折叠、抑制错误折叠蛋白聚集沉淀、解聚沉淀蛋白、介导错误折叠蛋白降解方面发挥重要作用。了解并掌握分子伴侣的作用机制，对于疾病致病机理的认知和疾病预防诊治的新方法开发具有重要意义。分子伴侣中均存在高度灵活的内在无序区域（intrinsically disordered regions，IDRs），这些IDRs平均占到分子伴侣氨基酸序列的36.7%。由于分子伴侣本身的复杂性以及IDRs的动态不均一性质，目前学术界仍然缺乏对分子伴侣中IDRs的详细功能研究与机制解析。

近期，华东理工大学全舒团队联合清华大学薛毅团队与国家蛋白质科学研究（上海）设施吴斌博士在Nature Communications发表了题为“Insights into the client protein release mechanism of the ATP-independent chaperone Spy”的研究论文。文章以分子伴侣Spy为研究对象，首次解析了Spy的N端无序区域（1-28位氨基酸残基区域）的功能与作用机制。作者表明Spy的N端无序区域能够动态性地同Spy的底物结合表面进行分子内相互作用，从而与底物蛋白产生竞争并促进底物蛋白从Spy表面释放。该工作是全舒团队继明确Spy分子伴侣功能[1]、阐释Spy结构灵活性与分子伴侣活性的关系[2]、解析Spy抗蛋白聚集沉淀机制[3]及鉴定Spy的生理底物[4]后的又一重要工作。

分子伴侣Spy是一种原始的折叠型分子伴侣，内含占氨基酸序列全长30%的内在无序末端。此外，其分子量较小且功能的发挥不依赖外界能量供给。这些特点使得Spy成为了研究分子伴侣内在无序区域工作机制的良好模型。首先，作者分别以及同时对Spy的无序N端与C端（125-138位氨基酸残基区域）进行删除，并且利用生物膜层反射光干涉技术测量了这些Spy突变体与底物蛋白的结合动力学。作者发现删除Spy的N端不影响底物的结合速率常数（k_on），但会显著降低底物释放速率常数（k_off），从而增强与底物蛋白的亲和力（K_d）。而C端无序区域的删除则不显著影响Spy与底物蛋白的结合与释放过程。这些结果表明Spy的无序N端具有促进底物释放的功能（图1）。随后，作者又通过逐步删除N端无序区域的氨基酸残基并测量突变体的底物结合与释放动力学常数，确定了N端无序区域上的D26氨基酸残基是N端发挥促进底物释放功能的关键（图1）。

图1 Spy的N端无序区域具有促进底物释放的功能

（图源：He et al., Nat Commun, 2022）

由于Spy的底物结合表面带大量正电荷（图2），并可通过静电相互作用介导与底物蛋白的初始结合。而D26氨基酸在实验pH条件下（pH=7.5）带负电，因此作者猜测D26位点可能通过静电相互作用介导Spy的N端无序区域与底物结合表面进行分子内结合，从而竞争性地促进底物释放。为验证这一猜想，作者首先通过氨基酸突变对D26位点的电荷进行了更换，作者发现当26位点不带电（A26）或带正电时（K26/R26），突变体的底物释放速率显著下降，只有当26位点带负电时（D26/E26），N端才具有促进底物释放功能（图2）。进一步，作者在25与26位点之间插入了一段GGGSGGGS柔性linker，以增加D26位点到Spy底物结合表面的距离，减小D26与Spy底物结合表面的静电相互作用。作者发现插入linker后，突变体的底物释放速率也降低了。这些结果从动力学水平上证明了作者的猜测。

图2 D26位点是N端无序区域促进底物释放的关键

（图源：He et al., Nat Commun, 2022）

为了从结构水平上对以上假设进行验证，作者还进行了分子内顺磁驰豫增强实验（intramolecular paramagnetic relaxation enhancement（PRE））与分子动力学模拟（Molecular Dynamics（MD）Simulations）。通过这些实验，作者表明D26位点与Spy的底物结合表面具有广泛的瞬时接触，而将D26突变为带正电的赖氨酸或精氨酸会明显减弱26位点与Spy底物结合表面的接触（图3）。并且通过完善的突变设计，结合分子内PRE实验与动力学测量，作者还鉴定到了Spy底物结合表面上参与同D26相互作用的主要氨基酸位点，即K54、R55、R61、R62与R89（图3）。最后，通过化学位移扰动实验，作者发现底物蛋白和Spy内在无序N端在Spy主体结构区域的结合位点十分类似（图3）。这些实验共同从结构水平上证明了作者的猜想。

图3 N端无序区域的D26氨基酸介导N端与Spy底物结合表面的分子内相互接触

（图源：He et al., Nat Commun, 2022）

图4 分子伴侣Spy的工作机制

（图源：He et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本文首次从动力学与结构水平对Spy的N端无序区域工作机制进行了解析：即Spy的N端无序区域通过位于其上D26氨基酸残基同Spy的底物结合表面上的关键正电氨基酸进行分子内静电相互作用，可有效与处于不同折叠状态的底物竞争，从而动态促进底物释放（图4）。该工作不但拓展了分子伴侣内在无序区域的功能，也回答了困惑领域内多年的ATP非依赖型分子伴侣如何不借助外界能量输入和明显构象变化而完成工作循环的问题。

尽管该研究解析了原始类型的分子伴侣如何不消耗能量而释放底物蛋白的机制，但目前人们仍旧不清楚决定分子伴侣功能的性质因素有哪些，这也是导致科学界至今尚未能成功进行人工分子伴侣蛋白设计的重要原因。随着结构研究技术以及人工智能的不断发展，我们相信应用这些技术对更多的分子伴侣系统尤其是较为原始的分子伴侣进行深入研究，最终会揭示分子伴侣的性质决定因素。这将指引我们成功设计人工分子伴侣蛋白，为合成生物学的发展增添新元件。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-30499-x

华东理工大学生物工程学院何为博士、清华大学生命科学学院博士研究生黎欣明为本文共同第一作者，华东理工大学生物工程学院全舒教授、清华大学生命科学学院薛毅教授、张江实验室国家蛋白质科学研究（上海）设施吴斌博士为本文共同通讯作者。研究获得了国家自然科学基金委、北京市结构生物学高精尖创新中心和清华-北大生命科学联合中心、上海市细胞代谢光遗传学技术前沿科学研究基地的经费支持。

第一作者作者何为（左一），黎欣明（左二）；通讯作者：全舒（中），薛毅（右二），吴斌（右一）

（照片提供自：全舒/薛毅/吴斌团队）

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参考文献  

1. Quan, S. et al. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 262–269 (2011).

2. Quan, S. et al. Super Spy variants implicate flexibility in chaperone action. Elife 3, e01584 (2014).

3.He, W. et al. Increased surface charge in the protein chaperone Spy enhances its anti-aggregation activity. J. Biol. Chem. 295, 14488–14500 (2020).

4.He, W. et al. Chaperone Spy Protects Outer Membrane Proteins from Folding Stress via Dynamic Complex Formation. mBio12, e0213021 (2021).

本文完