PNAS | 孙波课题组及合作者发现时间信号为调控多细胞信息网络主要因素

撰文︱孙波，李冠宇

责编︱王思珍

编辑︱夏叶

高等动物能够对规则的时间信号做出感知和预判，那么由一群神经细胞组成的极简系统是否也能实现这一功能？人类细胞所处的环境中的各类化学物质通常处于不断变化的状态中，因此正确的感受外界环境刺激并作出相应的反应是维持多细胞生物正常生存的必要能力[1, 2]。细胞外的各类化学物质分子作为配体（ligand）能够与细胞膜上的受体（receptor）相结合，从而触发细胞内部的一系列级联信号（cascade signaling）并由此调控细胞的一系列对外界的功能反应如运动性[3]、分化[4]、以及基因表达[4, 5]。在多细胞生物中，由于细胞间的异质性（cell-cell heterogeneity）及细胞处理信息产生噪音的影响（noisy signaling dynamics），细胞间将通过间隙连接（gap junction）等方式进行细胞间物质交换，通过这种细胞间信息交流的方式完成对外界复杂信息变化的感知与响应，这种现象被称为集体化学传感（collective chemosensing）。然而，尽管这种现象在生物学上有重大的意义，但对其内在原理和具体功能依然知之甚少。基于此，本文试图验证一个猜想：由大量单种神经细胞组成的生物极简系统可以通过集体化学传感对外部的时间信号做出应答。

2022年9月，美国俄勒冈州立大学的孙波教授和李冠宇及合作者在PNAS上发表了题为 “Temporal signals drive the emergence of multicellular information networks” 的文章，本文作者利用微流装置给与单层神经细胞周期性的刺激, 然后对细胞的应答反应进行两两因果分析，从而揭示串通所有细胞的一个深层网络。这个网络的连通性（connectivity）标志着细胞间信息传递的跃度。通过系统的分析该网络的结构，作者发现这种神经细胞自组织形成的网络处于一种去中心化的动态平衡。而且网络的连通性由外部时间信号以及内部分子通道共同调节。

作者通过过往研究已知ATP作为一种信号分子，能够通过与神经细胞表面的嘌呤能受体（purinergic receptor）引发细胞内质网向细胞质的钙离子释放以及细胞外部钙离子向细胞内的流入。由此细胞内钙离子浓度涨落可以通过荧光信号强度变化监测，于是作者设计了如下图所示的实验装置（图1A），通过电脑控制流量开关（flow switch）对单层神经细胞群落施加ATP浓度类似正弦函数的周期性刺激。下图（图1B）展示了显微镜视野内所有细胞整体荧光强度随时间变化的曲线，其整体变化趋势与外界刺激的ATP浓度变化曲线类似。

为了发掘出细胞间潜在的信息传递网络，作者着眼于每个细胞的最近邻对（nearest neighbor pair），这是由于实验中的神经细胞并没有轴突（axon）形成且专用于远程交流的分泌因子（secreted factor）会被连续不断的水流冲刷掉，故而作者认为只有相互紧挨者的细胞间通过间隙连接（gap junction）进行的细胞交流占主导地位。对每个邻对的细胞间（假设细胞A与细胞B形成邻对），作者使用了格兰杰因果分析：首先选取一回溯时间段长度d，在每一个时间节点t，使用回溯时间段【t，t-d】内的荧光强度数据对时间节点t+1的荧光强度数据进行预测。若使用细胞A与B共同数据对细胞B的预测要远好于使用细胞B自身数据进行的预测，那么认为细胞A为细胞B的因，细胞B为细胞A的果。由此构成的有向图如下图所示（图1 C, D），图中使用圆点指代细胞在显微镜视野内的位置，箭头指代细胞间的因果联系。

图1C中细胞的领导者/追随者分数（leader/follower score）代表了由该细胞传出/传入的箭头数量，图像中该数值分布随机并未出现明显的空间不对称性，这意味着网络并没有形成主导信息发送或主导信息接受的热点区域。图1D中细胞的整体极低的权威/中心分数（authority/hub score）佐证了作者的判断。由以上观察作者得出结论，周期性的外界刺激引起了神经细胞KTaR-1间的信息交流，并使得这些细胞自发组织成为了在空间上去中心化的因果网络。

图1. 用于揭示单层KTaR细胞潜在自组织的实验装置，整体相对钙离子强度变化以及通过格兰杰推理重建的细胞网络展示

（图源：G Li et al, PNAS, 2022）

首先，作者对该网络在连续两个周期内的变化进行了研究。对于一个有向图，其网络内部的两两细胞间连接无非会有以下三种变化（图2A）：1. 在上一个周期存在，在该周期内不存在。2. 在上一个周期不存在，在该周期内存在。3. 在上一个周期内存在，在本周期内存在但反转了方向。于是针对这三种情况，作者定义了相应的演化速率1. P_del 、2. P_add、3. P_flp 。图2B的箱型图展示了在不同周期长度刺激下三种演化速率的变化，值得注意的是，无论在怎样的周期下，已形成的连接反转方向的概率极低。同时，图2C展示出在不同周期长度的情况下，被删除连接的数量与新增连接的数量在每个连续周期内大致相等。综述所述，这意味着该因果网络在连续周期内的变化维持在动态平衡：即连接的指向性不变与连接的总数量不变（图2）。

图2. 多细胞网络在周期性ATP刺激下的动态演化，三种连接演化事件演化概率的箱型图，以及增减连接数值的对比

（图源：G Li et al, PNAS, 2022）

随后，作为细胞间信息传递跃度的标志，作者通过分析网络的连接概率来量化分析网络的连通性。本文中的连接概率定义为网络中的连接数量与最近邻对的数量（最大可建立连接的数量）的比值。图3A展示了随机调换较少数量细胞（10%）位置后造成的连通性变化，可见细胞位置的变化对网络连通性造成了显著影响。该结果展示了本文实验中的细胞交流仅局限于细胞的周边局部区域，这进一步支持了作者对细胞间交流由间隙连接主导的推断（图3A）。

接下来，作者希望探究外界刺激中主导网络连通性的因素。在本文中，可调节的外界因素为周期性刺激的周期长度以及ATP浓度，这两者分布代表了外界刺激的时间分布以及化学物质强度。图3B中的箱型图显示连接概率随周期长度增长而增长但ATP浓度的变化反而未能影响连接概率，由此可以得出结论：网络连通性由外界刺激的时间分布所主导而非化学物质强度（图3B）。

图3. 随机调换空间位置网络的连通概率与原网络对比及不同刺激条件下的连通概率对比

（图源：G Li et al, PNAS, 2022）

最后，作者与合作者通过实验结果与理论模拟的对比研究了细胞交流程度对网络的影响。如图4C所示，理论模型通过调控耦合常数（coupling constant）g的数值来模拟细胞间交流从较弱到较强的情景。而在实验中，作者通过使用棕榈油酸（palmitoleic acid）来抑制细胞通过间隙连接交流（以CX-指代）来实现较弱细胞交流（即g数值较小）；以氯化钾（potassium chloride，KCL）替代ATP从而达到细胞间通过膜电位加速细胞交流（即g数值较大）；以及普通细胞模拟正常细胞交流（即g数值适中）。理论与模型的定性对比均显示出网络的连接概率均在适中情况下达到最高值，过强或过弱的细胞交流程度均会导致网络连通性的降低。该结论说明了细胞交流的强弱程度同样影响着细胞的连通性进而调节细胞间信息传递（图4）。

图4. 模型预测连接概率随耦合常数变化及不同细胞交流程度下连接概率的实验数据

（图源：G Li et al, PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本文利用统计学的因果检验方法发掘出单层神经细胞内部所存在的信息交流网络，并发现在周期性刺激下，单层神经细胞可以自发形成在空间上去中心化的网络，同时在连续的周期演变过程中网络的连通性维持动态稳定。通过实验验证和理论比较，本文得出结论认为集体化学传感现象由外在刺激的时间信号以及内在的细胞间交流程度共同调控。本文在研究中结合了细胞生物学，统计学，网络科学以及计算数学的多种方法，初步揭示了外界的时间信号如何指导多细胞系统的自组织过程。作为引玉之作，仍然有许多不足之处或许值得读者进一步研究。首先本文中使用的生物模型过于简化，特别是没有如实地反映出真实大脑中细胞间的三维链接，以及不同种神经细胞间的互动。如果能够克服成像和数据分析的困难，或许可以用人工近脑组织（mini brain）得出更有代表性的结果。其次本文并没有对间隙连接的分子机制做细致的解析。神经细胞间的非突触交流在近年来逐渐成为神经科学的热点方向，有许多较为成熟的分子生物工具可以对此加以深入。最后，本文中的数学模型是基于现象学，并不模拟细胞内的信号传导。因此模型的解释具有一定的任意性。如果能够使用更为复杂的神经科学数学模型，或许可以对未来的实验做出更具体的预测和指导。对该现象的深入研究能够加深对正常或病变生理器官在面对外界化学刺激下的反应原理，从而能更好的理解从发育到神经元动力学再到器官组织等相关的生理学现象，其能够为疾病的致病原理及治疗提供帮助。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2202204119

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完