J Neuroinflammation︱卓业鸿/苏文如团队揭示铁死亡可能是视网膜缺血-再灌注的损伤新机制和治疗新靶点
视网膜缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤是临床上造成不可逆性视力损伤的常见原因，参与了青光眼、视网膜动脉阻塞和糖尿病视网膜病变[1-3]等多种眼病的病理过程。通过自由基损伤、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症级联反应以及半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）激活，引起视网膜结构改变、视网膜神经节细胞（RGC）死亡，最终导致视网膜功能丧失[4]。由于其具体机制的复杂性，目前临床上尚无彻底有效的治疗方法，仍以局部给药或手术治疗等对症处理为主。因此，进一步探索视网膜缺血-再灌注的损伤机制、研究寻找具有更大安全范围的替代疗法，对于针对性治疗威胁视力的眼病显得尤为重要。
铁死亡是一种以细胞内铁超载和脂质过氧化物的积累达到致死水平为特征的新型非凋亡性细胞死亡[5]。研究显示，在青光眼患者中，病理性高眼压可诱导RGC发生铁死亡。然而，铁死亡与视网膜细胞亚群之间的相关性仍亟待研究。
中山大学中山眼科中心卓业鸿教授团队长期致力于青光眼的免疫学机制和视神经损伤修复研究，其系列研究成果极大推动了青光眼学科临床转化领域进展。基于在神经免疫学和单细胞领域的系统性研究成果，2022年10月26日，中山大学中山眼科中心的卓业鸿教授、苏文如教授合作开展研究，作为共同通讯作者在Journal of Neuroinflammation（IF:9.587）杂志上发表了题为“Single-cell RNA sequencing reveals a landscape and targeted treatment of ferroptosis in retinal ischemia/reperfusion injury”的研究论文。研究者首次构建了小鼠视网膜缺血-再灌注损伤的单细胞图谱，提示靶向抑制铁死亡可有效保护视网膜结构和功能。这些结果揭示铁死亡特有的信号通路有望成为神经炎症性疾病，尤其是青光眼的潜在治疗靶点。
在这项工作中，研究者描绘了一个全面的视网膜单细胞图谱，揭示了小鼠I/R损伤后视网膜细胞亚群数量和基因表达的变化（图1）。单细胞数据表明，大部分视网膜细胞：视杆细胞（ROD）、视锥细胞（CONE）、视杆双极细胞（ROD）、视锥双极细胞（CBC）、无长突细胞（AC）、水平细胞（HC）、视网膜神经节细胞（RGC）、大胶质细胞（MAG）和血管内皮细胞（VEC）明显减少。各类免疫细胞：髓系细胞（MNEU）、T细胞和树突状细胞（T&DC）显著增加。特别是，其中存在大量血源性免疫细胞（单核细胞、中性粒细胞、T&DC）随着血-眼屏障(blood-ocular barrier)的损坏浸润到视网膜组织。这些证据表明，MNEU可能是视网膜缺血-再灌注损伤中重要的靶细胞。
图1 scRNA-seq揭示了I/R损伤后小鼠视网膜细胞异质性变化。研究者对I/R损伤后第三天的小鼠进行单细胞RNA测序分析，发现相比于空白小鼠，I/R组小鼠视网膜的神经细胞明显减少；免疫细胞显著增加。随后，研究者进行了I/R相关的DEG分析，显示铁代谢和铁死亡相关基因在模型组几乎所有视网膜细胞类型中高表达。
（图源：Li et al., J Neuroinflammation., 2022）
同时，铁死亡相关基因在光感受器、RGC和神经胶质细胞中表达上调。根据差异表达基因（DEG），研究者将视锥细胞聚类为SC0-SC3四个亚群，其中SC3高表达促炎因子(Ilβ， Il1a)和铁代谢相关基因(Fth1, Flt1和Hmox1)；类似地，视杆细胞也被亚聚类为SC0-SC3，炎症(S100a8和Il1b)和铁代谢相关 (Fth1、Flt1和Hmox1) 基因在SC2中富集；RGC则被细分为SC0、SC1两群，S100a8、S100a9、Cxcl2、Il1b、Flt1和Hmox1在SC0中高表达。在大胶质细胞的7个亚群中，I/R小鼠的SC1、SC2、SC3和SC5水平较高，而空白小鼠的SC0、SC4和SC6比例较大。SC3在I/R组中尤为突出。进一步检查发现急性炎症(Saa3、S100a8、S100a9和Cxcl2)和铁死亡相关(Fth1、Ftl1和Hmox1)基因显著上调。而髓系细胞的4个亚群在I/R组几乎全部增加。与现有的其它研究不同的是，研究者发现在I/R损伤过程中，几乎所有类型的视网膜细胞都发生了铁死亡。
给予铁死亡抑制剂Fer-1后，可明显抑制I/R诱导的RGC死亡（图2）、IBA-1阳性细胞活化及炎症反应。随后，研究者进行了体内、体外验证，发现铁死亡抑制剂Fer-1，发现可以显著降低RGC死亡率、抑制IBA-1阳性细胞激活、减轻炎症反应，从而改善I/R诱导的视网膜结构和功能损伤。
图2 抑制铁死亡可减少I/R诱导的RGC死亡和视网膜损伤。研究者经玻璃体腔注射Fer-1后，发现抑制铁死亡能显著提升RGC的存活率，增加视网膜IPL层厚度。
（图源：Li et al., J Neuroinflammation., 2022）
综上所述，这项工作从单细胞水平报道了缺血-再灌注（I/R）损伤后小鼠的视网膜细胞图谱，探索了不同类型的视网膜细胞互作机制，预测了铁死亡在视网膜I/R损伤中的重要作用，并验证了铁死亡抑制剂能够减少RGC死亡、减轻神经炎症反应，从而达到保护视网膜结构和功能的目的。然而，铁死亡的确切机制尚未阐明，且现有的铁死亡抑制剂大多是非特异性的，使得临床药物研究存在一定的局限性。同时，这也可能是未来研究的新方向。
中山大学中山眼科中心卓业鸿教授、苏文如教授为共同通讯作者。中山大学中山眼科中心博士研究生李洋洋、硕士研究生温宇文、博士研究生刘秀兴、李壮为共同第一作者。中山大学中山眼科中心、眼科学国家重点实验室、广东省眼科学与视觉科学重点实验室为第一单位。该项目研究得到国家自然科学基金支持。
通讯作者：卓业鸿（左），苏文如（右）
（照片提供自：中山大学中山眼科中心卓业鸿/苏文如团队）
卓业鸿，眼科学教授、主任医师，博士研究生导师，“珠江学者”特聘教授。主要致力于青光眼及近视眼防治研究。尤其在青光眼早期临床诊断、难治性青光眼诊疗，白内障青光眼联合手术治疗方面有丰富的临床经验。主持国家重点研发计划课题1项、国家自然科学基金项目7项、广东省自然科学基金-重大基础研究培育1项。以第一或通讯作者发表SCI论文58篇，其中Cell Death Differ（IF=15.820）1篇、Biomaterials (IF=14.58)1篇、Molecular Therapy (IF=11.454）1篇 、PNAS（IF=11.200）3篇。
苏文如，主任医师，博士研究生导师。“国家优青”基金获得者，“广东省杰青”基金获得者，临床上擅长葡萄膜炎等各种眼免疫性疾病和眼底疾病的诊断和治疗。目前主要研究方向为眼科免疫炎症性疾病的基础及临床研究，发表SCI论文91篇，通讯和第一作者论文68篇，其中IF>10论文15篇，IF>20分论文2篇，包括Nature communications, PNAS, Cell reports medicine, Cell Discovery等。获广东省科技进步一等奖1项，授权发明专利3项。
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参考文献（上下滑动阅读） 1. Goldblum, D. & Mittag, T. Prospects for relevant glaucoma models with retinal ganglion cell damage in the rodent eye. Vision Res 42, 471-478 (2002).
2. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B. & Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet 392, 1147-1159 (2018).
3. Osborne, N. N. et al. Retinal ischemia: mechanisms of damage and potential therapeutic strategies. Progress in retinal and eye research 23, 91-147 (2004).
4. Kim, B. J., Braun, T. A., Wordinger, R. J. & Clark, A. F. Progressive morphological changes and impaired retinal function associated with temporal regulation of gene expression after retinal ischemia/reperfusion injury in mice. Molecular neurodegeneration 8, 21 (2013).
5. Dixon, S. J. et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 149, 1060-1072 (2012).
本文完
1. Goldblum, D. & Mittag, T. Prospects for relevant glaucoma models with retinal ganglion cell damage in the rodent eye. Vision Res 42, 471-478 (2002).
2. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B. & Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet 392, 1147-1159 (2018).
3. Osborne, N. N. et al. Retinal ischemia: mechanisms of damage and potential therapeutic strategies. Progress in retinal and eye research 23, 91-147 (2004).
4. Kim, B. J., Braun, T. A., Wordinger, R. J. & Clark, A. F. Progressive morphological changes and impaired retinal function associated with temporal regulation of gene expression after retinal ischemia/reperfusion injury in mice. Molecular neurodegeneration 8, 21 (2013).
5. Dixon, S. J. et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 149, 1060-1072 (2012).
本文完