Mol Psychiatry︱庞志平/陈超/诺奖得主Thomas Südhof团队揭示孤独症风险突变获得性功能突触新机制
突触功能失调被认为是孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorders，ASDs）等神经发育和精神疾病的关键生理致病机制之一。Neuroligin 3是神经元细胞突触形成必不可少的细胞黏附分子，最早在家系遗传研究中发现其编码基因NLGN3中的一个罕见变异R451C与ASD密切关联[1]。由Thomas C. Südhof研究组率先构建的Nlgn3R451C基因敲入小鼠模型也是最早的孤独症小鼠遗传模型[2]。经过对Nlgn3R451C小鼠模型系统的研究发现R451C罕见突变能够引起小鼠社交障碍和神经突触传递异常等与ASD高度相关的表型[2-3]。尽管如此，该突变对人类神经元的影响尚未被研究。
2022年10月24日，中南大学陈超教授、美国罗格斯大学（Rutgers University）Zhiping P. Pang（庞志平）教授、斯坦福大学（Stanford University）诺奖得主Thomas C. Südhof教授团队合作在《分子精神病学》（Molecular Psychiatry）联合在线发表了题为“Analyses of the autism-associated neuroligin-3 R451C mutation in human neurons reveal a gain-of-function synaptic mechanism”的长文（该文被评选为封面文章），发现在人源胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）中基因敲入NLGN3-R451C罕见突变，并诱导成神经元（induced neurons，iNs）[3]显著降低NLGN3的蛋白表达水平，却增强谷氨酸能神经突触传递。该研究进一步利用人源神经元模型证实突触功能失调是导致ASD的关键细胞表型，为寻找可能的ASD治疗策略提供重要理论依据。（拓展阅读：诺奖得主Thomas C. Südhof团队先前工作，详见“逻辑神经科学”报道：Nature︱前沿! GluDs将不同突触前信号转导到不同突触后受体应答的机制）
人源NLGNs家族由NLGN1（3q26）、NLGN2（17p13）、NLGN3（Xq13）、NLGN4X（Xp22.3）和NLGN4Y（Yq11.2）五个基因组成。NLGNs作为神经细胞突触粘附分子，在神经突触形成和功能上发挥着极为重要的作用[4]。以往对NLGN3基因研究多集中在遗传改造小鼠模型中，而关于该基因在人源神经元中功能的研究甚少。为在人类遗传背景下研究NLGN3-R451C罕见遗传突变效应，作者利用CRISPR-Cas9对ESC X染色体NLGN3编码区同源特异性敲入R451C突变，并采用此前建立的iNs模型[5]，即在干细胞中通过条件性过表达转录因子Ngn2（Neurogenin 2）诱导谷氨酸能神经元（Ngn2 神经元）[6]，通过条件性过表达转录因子Ascl1（Achaete-Scute Family BHLH Transcription Factor 1）和Dlx2（Distal-Less Homeobox 2）诱导GABA能神经元（AD 神经元）[7]，分别对两种神经元的突触传递进行了功能分析。结果表明，NLGN3-R451C突变显著增强了谷氨酸能神经元mEPSC的频率，而GABA能神经元mIPSC频率和振幅均未显著变化。此外，在人源Ngn2 神经元中基因敲除NLGN3显著降低了mEPSC频率。这表明R451C在人源神经元模型中是一种功能获得性突变，增强了AMPA介导的谷氨酸能突触传递（图1）。
图1 NLGN3 R451C增强兴奋性神经突触传递
（图源：Wang, L. et al., Mol Psychiatry, 2022）
由于体外培养的iNs模型缺乏体内相应的生理环境，长时间体外培养往往会引起细胞应激。在啮齿动物模型中移植人神经细胞目前已经被用于研究人神经元发育及其功能[8-9]。因此，作者采用一种双色标记基因型（Dual color genotypes）的策略，将对照和R451C Ngn2 神经元（分别标记mCherry和mVenus）共移植到新生免疫缺陷小鼠前脑区域。两种基因型的Ngn2 神经元完全发育在相同的体内环境中。在成年后小鼠脑中发现，人源Ngn2 神经元在形态和功能上与小鼠内源神经环路进行了整合。进而，采用脑片电生理对同一小鼠脑内移植的不同基因型神经元进行记录，从而降低移植过程和动物个体造成的偏差。结果表明，R451C基因型神经元 mEPSC频率的大幅增强。这也进一步证实R451C突变是通过获得性功能影响谷氨酸能神经突触传递，从而改变脑内兴奋/抑制的平衡作用于孤独症的发病机制（图2）。
图2 双荧光基因型移植WT和NLGN3 R451C神经元
（图源：Wang, L. et al., Mol Psychiatry, 2022）
为了解NLGN3-R451C在人源神经元中导致的分子水平变化与神经突触相关的表型之间的关联，作者对体外共培养的神经元模型进行了单细胞转录组分析。差异表达分析和功能注释[10]结果表明，在不同类型的神经元中显著上调差异表达基因（Differential expressed genes，DEGs）均富集于神经突触功能相关基因通路。为了进一步了解R451C所导致的DEGs与ASD、精神分裂症（Schizophrenia，SCZ）、双相情感障碍（Bipolar disorder，BD）和重度抑郁症（Major Depressive Disorder，MDD）等神经发育和神经精神疾病是否存在潜在的关联。作者对不同神经细胞类型的DEGs与收集的ASD、SCZ、BD和MDD遗传风险基因，死后人脑差异表达基因，死后人脑基因共表达模块基因等疾病相关基因集进行了富集分析。结果显示，主要神经细胞类型的DEGs与ASD、SCZ和BD不同类型的风险基因集呈现程度不同的显著富集。而MDD和作为对照的身体质量指数在分析中没有任何程度的富集。这表明NLGN3-R451C突变造成的基因表达网络的改变可能在SCZ和BD中起到同样关键作用，而MDD的分子机制与其他三类神经精神疾病、神经发育疾病可能有所不同（图3）。
图3 人诱导神经元单细胞测序
（图源：Wang, L. et al., Mol Psychiatry, 2022）
综上所述，该研究结合基因编辑、人干细胞诱导神经元模型、双基因型细胞移植模型、电生理膜片钳和单细胞测序揭示了孤独症NLGN3 R451C罕见突变获得性功能，增强了AMPA受体介导的谷氨酸能神经突触传递。同时，该研究为孤独症神经突触机制提供了新的证据。此外，人干细胞诱导神经元模型以及双基因型细胞移植模型为研究神经发育，神经精神疾病提供了新的研究模型。不足的是，该罕见突变所导致的分子机制并未明确。此外，NLGN3作为突触后膜蛋白在胶质细胞中也存在广泛表达，该突变是否也介导神经、胶质细胞互作有待在未来的研究中进一步明确。
中南大学、罗格斯大学联合培养王乐博士和罗格斯大学Vincent R. Mirabella博士为该论文的共同第一作者。庞志平教授、Thomas C. Südhof教授和陈超教授为论文的共同通讯作者。该工作还得到上州州立大学Chunyu Liu教授、罗格斯大学Peng Jiang教授、Ronald P. Hart教授、普渡大学助理教授Ranjie Xu等的大力支持。Rutgers Pang lab长期招收神经生物学相关专业博士后，详情请见：https://pang-lab.org
通讯作者：陈超教授（左）、庞志平教授（中）、Thomas C. Südhof教授（右）
（照片来源：陈超/庞志平/Thomas C. Südhof 实验室）
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参考文献（上下滑动阅读） [1] Jamain S, Quach H, Betancur C, Rastam M, Colineaux C, Gillberg IC et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet 2003; 34(1): 27-29.
[2] Tabuchi K, Blundell J, Etherton MR, Hammer RE, Liu X, Powell CM et al. A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science 2007; 318(5847): 71-76.
[3] Etherton M, Foldy C, Sharma M, Tabuchi K, Liu X, Shamloo M et al. Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108(33): 13764-13769.
[4] Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature 2011; 476(7359): 220-223.
[5] Ribeiro LF, Verpoort B, de Wit J. Trafficking mechanisms of synaptogenic cell adhesion molecules. Mol Cell Neurosci 2018; 91: 34-47.
[6] Zhang Y, Pak C, Han Y, Ahlenius H, Zhang Z, Chanda S et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron 2013; 78(5): 785-798.
[7] Yang N, Chanda S, Marro S, Ng YH, Janas JA, Haag D et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nat Methods 2017; 14(6): 621-628.
[8] Xu R, Brawner AT, Li S, Liu JJ, Kim H, Xue H et al. OLIG2 Drives Abnormal Neurodevelopmental Phenotypes in Human iPSC-Based Organoid and Chimeric Mouse Models of Down Syndrome. Cell Stem Cell 2019; 24(6): 908-926 e908.
[9] Xu R, Li X, Boreland AJ, Posyton A, Kwan K, Hart RP et al. Human iPSC-derived mature microglia retain their identity and functionally integrate in the chimeric mouse brain. Nat Commun 2020; 11(1): 1577.
[10] Koopmans F, van Nierop P, Andres-Alonso M, Byrnes A, Cijsouw T, Coba MP et al. SynGO: An Evidence-Based, Expert-Curated Knowledge Base for the Synapse. Neuron 2019; 103(2): 217-234 e214.
本文完
[1] Jamain S, Quach H, Betancur C, Rastam M, Colineaux C, Gillberg IC et al. Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat Genet 2003; 34(1): 27-29.
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本文完