PNAS︱刘俊宇团队揭示连接蛋白半通道在减轻颞叶癫痫发病过程中的神经炎症和过度兴奋的重要作用

撰文︱郭安妮，刘俊宇

责编︱王思珍，方以一

编辑︱夏   叶

癫痫是最常见的神经系统性疾病之一，表现为自发和反复的癫痫发作。癫痫发作是由一群高度同步的神经元放电形成的，最早出现在癫痫易感区域，并且扩散到大脑的其他区域。尽管世界上约有五千万人正遭受癫痫的困扰，约三分之一的病人对现有的抗癫痫药物具有抗药性[1]。现有的抗癫痫药物主要靶点是突触或神经元，通过调节离子通道的活性或突触传递来调控神经元的活性[1]。考虑到有如此大的病人群体有抗药性，发现新的靶点或机制来治疗癫痫症乃至关重要。

星形胶质细胞在调节神经元的活动中有重要作用。其中很重要的一种方式就是通过连接蛋白半通道（connexin hemichannel）释放胶质递质（gliotransmitters），例如谷氨酸盐、D-丝氨酸、ATP [2-6]。在癫痫的发病过程中，连接蛋白半通道开放程度的上升会导致过量的胶质递质被释放到神经元的周围，从而进一步增强神经炎症和神经元的兴奋性[4-6]。连接蛋白半通道是否可以作为颞叶癫痫治疗的有效靶点呢？抑制连接蛋白半通道在颞叶癫痫的发病过程中会有什么样的作用呢？针对这些问题，研究人员开展进行了一系列研究。

2022年11月2日，香港城市大学的刘俊宇团队在《美国科学院院报》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）杂志上发表了题为“Inhibition of connexin hemichannels alleviates neuroinflammation and hyperexcitability in temporal lobe epilepsy”的研究论文。郭安妮博士为论文第一作者，刘俊宇博士和Juan C. Sáez教授为共同通讯作者。通过使用一种名为D4的连接蛋白半通道新型抑制药物，该论文揭示了连接蛋白半通道在减轻颞叶癫痫发病过程中的神经炎症和过度兴奋的重要作用。

首先，研究人员探究了连接蛋白半通道抑制剂D4对毛果芸香碱（pilocarpine）造模的癫痫动物存活率的影响。D4的预处理将癫痫小鼠在造模七天后的存活率从46%提高到74%（图1A-B）。接下来，为了探究D4对癫痫引起的神经炎症反应的影响，研究人员检测了GFAP和Iba1，来反映星状细胞和小胶质细胞的表达情况。在癫痫造模的七天后，毛果芸香碱显著地提高了星状细胞和小胶质细胞在梨状皮质和海马中的表达，而D4的预处理降低了星状细胞在梨状皮质以及小胶质细胞在梨状皮质和海马的表达，D4的后处理挽救了由毛果芸香碱引起的星状细胞和小胶质细胞在梨状皮质和海马中的过量表达（图1C-F)。

图1：D4提高癫痫动物的存活率并降低了星状细胞和小胶质细胞的过量表达

（图源：Guo A, et al., PNAS, 2022）

接下来，为了探究D4对癫痫引起的神经元过度兴奋的影响，研究人员做了两个实验。首先，研究人员记录了海马CA1区域的单个锥体神经元（Pyramidal neuron）的自发性抑制性突触后电流（spontaneous inhibitory postsynaptic currents, sIPSCs）。在癫痫造模的三天后，CA1锥体神经元sIPSC的幅值和频率降低，而D4的预处理提高了sIPSC的频率，说明D4减轻了由癫痫引起的神经元的抑制性降低（图2A-C）。其次，研究人员在癫痫大发作时记录了麻醉动物的初级运动皮层的局部场电位（local field potential）。D4极大程度地降低了电图癫痫活动（electrographic seizure activity），癫痫样棘波（epileptic spikes）的数量以及高幅值棘波（high-amplitude spikes）的比例（图2D-H）。

图2：D4减轻了癫痫引起的抑制性突触后电流降低以及电图癫痫活动。

（图源：Guo A, et al., PNAS, 2022）

接下来，为了探究癫痫发病过程中的分子事件和基因表达，研究人员使用了实时定量PCR来检测突触和炎症相关基因的mRNA表达。研究人员发现在造模后三天，在梨状皮质和海马中，突触相关基因（包括gad1, vglut1, homer1, pvalb）表达量降低，而炎症相关基因（包括gfap, cd68, trem2, cx3cr1, tlr9, c3, nlrp3, tnf, tnfr1）表达量显著升高。三次剂量的D4后处理升高了突触相关基因的mRNA表达，而一次和三次剂量的D4后处理均降低了炎症相关基因的mRNA表达（图3A-C）。

图3：D4的后处理挽救了癫痫引起的炎症和突触相关基因mRNA水平的改变

（图源：Guo A, et al., PNAS, 2022）

紧接着，研究人员利用羧基荧光素（carboxyfluorescein，CBF）进行上色实验来探究D4作用的机制。羧基荧光素是一种可以通过打开的连接蛋白半通道进入细胞里的染料，羧基荧光素的上色率可以间接反映出连接蛋白半通道的活性。研究人员发现来自癫痫动物的急性脑切片的梨状皮质和海马中，羧基荧光素的总上色率以及在星状细胞中的上色率上升，说明连接蛋白半通道的活性升高。而且不论是在急性脑切片还是在动物体内的D4处理，都可以降低梨状皮质和海马中羧基荧光素的总上色率以及在星状细胞中的上色率（图4A-D,补充图6-7）。这些结果反映了D4能抑制癫痫引起的连接蛋白半通道的活性升高。

图4：体外或体内的D4处理抑制了海马脑切片中癫痫引起的连接蛋白半通道的活性升高

（图源：Guo A, et al., PNAS, 2022）

为了探究D4与不同类型的连接蛋白半通道和缝隙连接通道（gap junction channel）的作用机制，研究人员做了一系列分子模拟对接（molecular docking）实验。研究人员比较了D4与Cx43连接蛋白半通道或缝隙连接通道或Cx39连接蛋白半通道之间的结合位点（binding site）以及结合亲和力（binding affinity），发现相对于Cx43缝隙连接通道或Cx39连接蛋白半通道，D4与Cx43连接蛋白半通道之间有着更强的结合亲和力（图5A-E）。

图5：Cx43和Cx39连接通道的分子模型以及与D4的结合

（图源：Guo A, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究利用连接蛋白半通道抑制剂D4，结合癫痫动物模型，免疫荧光，实时定量 PCR 检测，全细胞膜片钳电生理记录，局部场电位记录和分子模拟对接等技术，从细胞，脑片及动物水平上，揭示了D4通过抑制星状细胞上的连接蛋白半通道的活性，来抑制癫痫发病过程中的神经炎症反应和神经元过度兴奋，从而达到有效的抗癫痫效果。当然，这项研究还存在一些有待解决的问题，比如D4在动物体内的代谢情况，是D4 本身还是D4的代谢物来行使抑制连接蛋白半通道的作用？D4对不同连接蛋白半通道的特异性和效率是什么？除了Cx43连接蛋白半通道，D4是否会引起通过二级反应引起其他通道活性的变化？

总而言之，该研究发现抑制连接蛋白半通道可以减轻癫痫发病过程中的神经炎症反应和过度兴奋，为癫痫疾病的治疗提供了新的视角。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2213162119

通讯作者：刘俊宇（右）；第一作者：郭安妮（左）

（照片提供自：刘俊宇实验室）

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1. C. Garcıa-Rodrıguez, I. D. Bravo-Tobar, Y. Duarte, L. C. Barrio, J. C. Saez, Contribution of on-selective membrane channels and receptors in epilepsy. Pharmacol. Ther. 231, 10798025. T. D. Montero, J. A. Orellana, Hemichannels: New pathways for gliotransmitter release. Neuroscience 286, 45–59 (2015).

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本文完