年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种神经炎症性疾病，受遗传和环境因素（例如肥胖）影响，也是导致失明的主要原因。在AMD早期，视网膜下色素上皮（RPE）空间出现玻璃膜疣（drusen）的不可溶性沉积物，主要成分包括脂质、蛋白质、羟基磷灰石和微量金属。视网膜的小胶质细胞、巨噬细胞及单核细胞会被招募以清除玻璃膜疣；若不能及时、完全的清除玻璃膜疣，则会进一步引发病理炎症和血管生成反应，从而导致组织损伤，发展成晚期AMD [1,2]。晚期AMD分为两种形式，新生血管性AMD（nAMD，也叫“渗出性”）和非新生血管性AMD（“萎缩性”）。其中nAMD可导致AMD患者80%以上的视力丧失，其病理特征是黄斑下脉络膜异常血管的生长，称为脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）。除了局部免疫反应外，AMD的进展还受到全身炎症加剧的影响。系统性炎症如何影响AMD仍有待阐明。有研究表明，nAMD患者的内脏脂肪组织体积显着增加；腰臀比每增加0.1，晚期AMD的几率增加75%；较高的体重指数（BMI > 30）与晚期AMD进程和患病年数相关[3-5]，这些临床研究结果提示，肥胖或超重可能加速晚期AMD进程，然而机制未知。2023年1月6日，来自蒙特利尔大学的Przemyslaw Sapieha团队在Science上发表了题为“Past history of obesity triggers persistent epigenetic changes in innate immunity and exacerbates neuroinflammation”的文章，通过转座酶可及的染色质（ATAC-seq）、ChIP-qPCR及流式分选等技术，揭示了早期饮食诱发的肥胖会引发先天免疫系统的重编程，这种表观改变即使在减肥或代谢正常后也持续存在。硬脂酸结合Toll样受体4（TLR4），可重塑染色质图谱并选择性地增强激活蛋白1（AP-1）结合位点的可及性。骨髓细胞的氧化磷酸化向糖酵解转变，最终导致促炎细胞因子转录、病理性视网膜血管生成异常以及视神经变性。该研究证明了肥胖史会重新编程单核吞噬细胞，使个体更易患神经炎症。首先，研究人员建立了增重-减重（WGWL）实验，雄性C57BL/6J小鼠进行11周的高脂肪饮食（HFD：60%脂质含量）中诱发肥胖，后将它们转为持续9周的常规饮食（RD：10% 脂质含量）以减轻体重（HFD-RD小鼠），并在两个时间点分别检测体重、糖耐量（GTT）和胰岛素耐受（ITT）实验，发现HFD引起的体重增加、糖耐量和胰岛素耐量降低，在转成正常饮食后恢复正常（图1A-G）。喂养20周后用激光照射小鼠眼睛进行CNV造模，两周后进行检测。结果发现，HFD-RD小鼠的CNV增加了40%（FITC信号）（图 1 H-K），IB4标记的病变区域的平均大小在各组之间没有差异，表明观察到的效果直接作用于新生脉管系统（图1 J- K），两组小鼠的单核吞噬细胞（MNP）和小胶质细胞（IBA1）数量没有差别（图1 H& L）。以上结果提示，肥胖史对个体存在长期影响，表现为视网膜组织中的新血管形成增强，而不影响与病变相关的MNPs的数量。图1 高脂饮食引起的GTT和ITT的变化及对CNV的影响（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）
鉴于脂肪组织是最大的免疫活性器官之一，且在肥胖期间会发生形态和功能变化，研究人员测试了有肥胖史的小鼠的脂肪组织是否有致病性。研究人员进行了脂肪组织移植（ATT），将500 mg来自RD-RD小鼠或HFD-RD小鼠的附睾内脏白色脂肪组织（eWAT）移植到C57BL/6J受体小鼠中（图 2M）。术后检测发现，移植物正常且血管化没有坏死（图 2N）。移植后三周，受体小鼠接受激光诱导的CNV。移植HFD-RD ATT的小鼠比RD-RD ATT受体小鼠或假手术小鼠产生了更多的CNV（图2 O-R），招募到损伤部位的 MNP 数量在组间没有显着差异（P = 0.55）（图 2S）。总之，以上结果表明：尽管体重、代谢恢复正常，但肥胖史小鼠的脂肪组织仍可促进病理性新生血管形成。（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）脂肪组织为何存在促进病理性新生血管形成的记忆？研究人员进一步做了分析，发现HD-RD小鼠脂肪组织的大小和分布发生了变化，脂肪组织中的促炎巨噬细胞（adipose tissue macrophage，ATM，包括F4/80+、EMR1+、CD11b+, CD38+）是RD-RD小鼠的3倍（图3F-I）。为了进一步验证ATM如何影响CNV，研究人员将来自于LysMcre+:Ai3EYFP+小鼠（单核细胞、成熟巨噬细胞和粒细胞被标记了荧光（图 J）的脂肪组织移植到正常小鼠中，3周后诱导CNV。发现CNV部位的荧光标记细胞明显增加，说明脂肪组织来源的髓系细胞直接浸润 CNV 病变部位并促进炎症，促进疾病进展。图3 脂肪组织来源的髓系细胞直接浸润 CNV 病变部位并促进炎症（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）接着研究人员使用实时定量PCR（RT-qPCR）评估了从RD-RD小鼠和HFD-RD小鼠骨髓（Bone Marrow，BM）分离的单核细胞中先天免疫相关基因的转录水平，发现与RD-RD对照相比，HFD-RD小鼠中的白细胞介素1b（Il1b）和Il6显著升高（图2 M）。为了测试肥胖史小鼠的BM能否促进CNV进展，研究人员进行了骨髓移植实验（Bone Marrow Transplant，BMT），将HFD-RD（CD45.2）小鼠的BM转移转移到受致死照射的 B6.SJL（CD45. 1）受体小鼠（图 4N）。BMT 八周后，循环的单核细胞群表达供体小鼠的泛造血细胞标记物CD45的等位基因，证明转移成功（图 4O）。当嵌合小鼠在BMT后8周接受激光诱导的CNV时，接受HFD-RD小鼠BMT的小鼠比接受RD-RD BMT的小鼠产生更多的CNV（图4 P-Q）。因此，肥胖史小鼠移植髓系细胞可重塑脂肪组织，并驱动CNV。图4 肥胖史小鼠的髓系细胞可重塑正常小鼠的脂肪组织，并诱发CNV（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）接着，研究人员利用ATAC-Seq测序分析了高脂饮食引起的肥胖小鼠中ATM的表观遗传变化。结果显示，RD-RD小鼠与HFD-RD小鼠ATM之间差距最多，存在4989 差异可及性区域（DAR）（图 5D）。2022个DAR存在于RD-RD v.s HFD-RD小鼠中，而非RD-RD v.s HFD-RD小鼠中，验证了肥胖史可持续性的影响ATM的表观遗传。（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）进一步做功能上的GO分析发现，“血管生成”和“炎症反应”的基因集中，HFD_RD小鼠ATM的AP-1的靶向基因，例如Il1b、B细胞中kappa轻链多肽基因增强子的核因子1（Nfkb1）、Tnf α诱导蛋白3（Tnfaip3）、血管内皮生长因子 A（Vegfa）、血管生成素1（Angpt1）、血小板衍生生长因子受体（Pdgfr）和β多肽（Pdgfrb）可及性高，而Il10可及性低（图6G），生信分析的结果进一步在小鼠实验上得到了验证（图6 I-P）。以上结果提示，肥胖史会导致内脏脂肪组织发生持续的促炎性变化，并且在实验性损伤后容易增加全身炎症。（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）HFD中的哪种脂质驱动了表观遗传的改变？研究人员使用气相色谱-质谱法（GC-MS）对RD-RD和HFD_RD小鼠进行定量脂肪酸（FA）分析，发现硬脂酸 (Stearic Acid，SA，C18:0）在HFD期间明显增加，并回复正常饮食之后恢复到正常水平（图7 A-B）。（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）SA是否参与了脂肪组织的持续性变化？研究人员分离出髓系巨噬细胞，加入SA孵育24小时后给予LPS连续刺激5天，发现SA预处理的髓系巨噬细胞（BMDM）的Tnf、Tnfaip3、Il6和Nfkb的mRNA的表达增加（图8 C-D）。而这一改变不存在于TLR4全敲的小鼠中（图8 E-F），说明SA结合TLR4受体介导了BMDM对LPS反应的变化。图8 SA预处理对于BMDM细胞响应LPS刺激的影响（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）由于细胞的能量代谢会影响细胞的表型和功能[6]，研究人员猜想SA是否通过改变BMDM的代谢来诱发先天免疫记忆的机制。通过比较对照组（BSA）和SA预处理组BMDM的耗氧率（oxygen consumption rate，OCR），LPS刺激前后的OCR发现，在SA预处理的BMDM基础呼吸和最大呼吸量降低（图9 L-N）；通过比较细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）发现，SA预处理组的BMDM糖酵解途径增强（图9 O-Q），以上结果说明，肥胖史可通过改变BMDM的能量代谢程序形成先天免疫记忆。（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）最后，基于ATAC-Seq生信分析的结果，研究人员发现HD-RD小鼠ATM的AP-1转录因子家族结合位点的可及性增加，包括c-JUN、c-FOS和ATF。基于基序丰富（HOMER）基序搜索的超几何优化后，发现排名前八的最高基序对应于AP-1家族成员的结合位点。已有研究表明，AP-1自身的结合可通过募集触发促炎基因的组蛋白修饰酶导致染色质重塑。因此，研究人员接下来检测了SA暴露后，c-JUN（AP-1家族的主要成分）和组蛋白乙酰转移酶（HAT）是否被募集到 Tnf 基因启动子上（图 10 D）。结果显示，用SA刺激BMDMs 1小时会增加c-JUN的磷酸化（图 10 E-G）。染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析显示，在用SA处理的细胞中，募集到Tnf基因的启动子区域的，c-JUN和EP300增加，赖氨酸27 (H3K27ac）上组蛋白H3乙酰化的显着增加（图 10 H-J）。这些结果表明，巨噬细胞重编程的机制有可能是与 SA 结合的AP-1位点发生了染色质重塑。图10 SA预处理导致BMDM AP-1结合位点的染色质重塑（图源：Hata M, et, al., Science, 2023 ）文章结论与讨论，启发与展望总之，本研究发现肥胖病史有可能在ATM等组织驻留髓细胞中诱导长期染色质重塑，导致不同的髓系细胞（如ATM和视网膜小胶质细胞）更容易引发促血管生成和促炎反应，即使体重和代谢状态已恢复正常，这些细胞也可能会加剧炎症发生，最终加剧远端组织（如视网膜）实验性损伤后的神经炎症。先天免疫细胞染色质图谱的持续变化加剧了实验模型中的病理性血管生成和神经元变性，表明系统先天免疫与视网膜疾病之间存在联系。因此，针对先天免疫系统表观遗传重编程或消除重编程先天免疫细胞亚群的治疗方法可能会延缓或预防新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）和非新生血管性AMD的进展。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj8894
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1. Xu, H. et al. (2009) Para-inflammation in the aging retina. Prog Retin Eye Res 28, 348-368. 10.1016/j.preteyeres.2009.06.0012. Rashid, K. et al. (2019) Microglia in Retinal Degeneration. Front Immunol 10, 1975. 10.3389/fimmu.2019.019753. Seddon, J.M. et al. (2020) Rare and Common Genetic Variants, Smoking, and Body Mass Index: Progression and Earlier Age of Developing Advanced Age-Related Macular Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 61, 32. 10.1167/iovs.61.14.324. Haas, P. et al. (2015) Impact of visceral fat and pro-inflammatory factors on the pathogenesis of age-related macular degeneration. Acta Ophthalmol 93, 533-538. 10.1111/aos.126705. Adams, M.K. et al. (2011) Abdominal obesity and age-related macular degeneration. Am J Epidemiol 173, 1246-1255. 10.1093/aje/kwr0056. Ganeshan, K. and Chawla, A. (2014) Metabolic regulation of immune responses. Annu Rev Immunol 32, 609-634. 10.1146/annurev-immunol-032713-120236