声音可以传递重要的信息包括个体社交状态、位置以及经验等，是鸟类，啮齿类动物，非人灵长以及人类等物种种内交流的重要媒介[1]。声音的产生需要身体多个器官的相互协调，在中枢神经系统中对发声机制的研究主要集中在神经环路层面。在小鼠中报道与发声相关的脑区主要有medial preoptic area（MPOA）、ventromedial hypothalamus （VMH）、periaqueductal gray（PAG）、nucleus retroambiguus（RAm）和central-medial boundary zone of the amygdala（AmgC/M）[2-5]。在这些脑区中PAG脑区被认为是发声的一个门控，在小鼠中控制发声的信息从其他脑区汇集到PAG经过Ram，然后到达喉部肌肉产生声音。在哺乳动物（小鼠、猫、狗和猴子等）中用双侧损伤或失活PAG脑区导致动物不能发声，相反用电或化学药物激活PAG脑区神经元则可以激发声音的产生[6-10]。Tschida等通过CANE（Capturing Activated Neuronal Ensembles）技术进一步标记了USV（ultrasonic vocalization）神经元[2]。虽然目前对调控声音产生的脑区和环路已经有了较多的理解，但是对于控制发声产生的分子机制并不清楚。最近，清华大学医学院贾怡昌教授课题组在Molecular Psychiatry杂志上发表了题为“TCF7L2 acts as a molecular switch in midbrain to control mammal vocalization through its DNA binding domain but not transcription activation domain”的研究论文。该研究揭示了调控小鼠发声的分子机制。FOXP2是第一个被报道和人类语言功能相关的基因，将病人中FOXP2的电突变引入小鼠中，同样会损害小鼠的发声[11]。这提示在一定程度上小鼠可以作为一种模式动物模拟人类语言功能紊乱。为了寻找和发声相关的基因，作者通过化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）对小鼠基因进行诱变，然后对发声缺陷的小鼠进行筛选（图1a），通过外显子测序发现Tcf7l2基因的Y337H点突变造成了小鼠发声功能的损害，从图中可以明显的看出Y337H/+突变小鼠音节数量显著的减少（图1b）。（图源：H.Qi et al., Mol Psychiatry, 2023）为了进一步探究Tcf7l2对成年小鼠交流的影响，作者用发情的雌鼠来诱导野生型（+/+）和基因突变（Y337H/+）雄鼠发声，从图中可以看到突变小鼠发出的音节数目明显减少(图2a)，并且突变小鼠发出简单音节（simple）的比例显著的升高，而发出复杂音节（multiple）的比例显著降低（图2b）；同时，相比于野生型小鼠Y337H/+突变小鼠从s、u、d、m音节向m音节转换的比例也明显降低，并且突变小鼠从s、d、m音节向Silence转换的比例明显较高（图2c）。这些结果表明Tcf7l2基因突变同样影响成年小鼠的发声交流，并且降低了发出的音节的复杂度，同时影响了不同音节之间的转换，突变小鼠的音节序列更容易被中断。（图源：H.Qi et al., Mol Psychiatry, 2023）免疫荧光染色的结果显示TCF7L2在PAG和ICe脑区高表达(图3a)，而PAG是控制发声的关键脑区，因此，作者在P17时分别在Tcf7l2 exon11 fl/fl小鼠PAG注射Syn1-mCherry-Cre和Syn1-mCherry病毒（图3b），发现在PAG特异敲除Tcf7l2损害了小鼠发声（图3c），同时电生理实验也表明Tcf7l2基因的缺陷，损害了PAG脑区神经元突触的传递（图3d-e）。图3 Tcf7l2在中脑表达对小鼠超声是必须的，失去Tcf7l2损害突触传递（图源：H.Qi et al., Mol Psychiatry, 2023）Tcf7l2包含两类转录本，一类含有β-catenin结合结构域，可以被β-catenin结合从而激活下游基因的转录；另一类不含有β-catenin结合结构域，因此不能被β-catenin激活，这一类转录本特异的在脑组织表达。为了探究这两类转录本对小鼠超声的影响，作者首先用Vglut2-Cre的小鼠与Tcf7l2 exon1 fl/+的小鼠杂交，这样就可以特异的敲除长的转录本而不影响短的转录本表达，作者发现单独敲除Tcf7l2长的转录本足以损害小鼠超声(图4a-b）。那么短的转录本是否影响小鼠超声呢？由于短的转录本的起源并不是很清楚，因此，作者首先用Nanopore测序确定短的转录本的起源，发现在第5个内含子中存在10个短的转录本的起始位点（图4c），提示短的转录本可能存在复杂的调控，并且作者通过反转录PCR，作者证实确实存在这些转录起始位点（图4d）。随后作者用Cas9技术将这些转录起始位点特异敲除，而不影响长的转录本的表达（图4e），发现特异敲除短的转录本同样损害了小鼠超声，这暗示在调控发声中Tcf7l2长和短的转录本就有相同的作用（图4f），最后作者通过双荧光素酶报告实验发现Y337H点突变解除了短的转录本对转录的抑制（图4g），这提示Tcf7l2的转录抑制活性对小鼠发声是至关重要的。图4 Tcf7l2长和短的转录本对小鼠发声都是必须的（图源：H.Qi et al., Mol Psychiatry, 2023）SFARI数据库显示Tcf7l2是自闭症的一个风险基因，因此，作者将自闭症病人的Tcf7l2的点突变引入小鼠，发现自闭症病人的两个点突变都导致小鼠发声功能受损（图5b-c），这一数据提示Tcf7l2点突变小鼠在一定程度上可以模拟人类自闭症的表型，对药物开发和试验具有重要的意义。（图源：H.Qi et al., Mol Psychiatry, 2023）（图源：H.Qi et al., Mol Psychiatry, 2023）综上所述，作者用正向遗传学筛选和基因敲除验证确定了Tcf7l2参与小鼠发声，并且通过立体定位注射的方法发现Tcf7l2在PAG脑区发挥功能，随后，特异的敲除Tcf7l2不包含激活结构域的短的转录本同样损害小鼠发声，暗示着Tcf7l2的转录抑制对小鼠发声是至关重要的，最后，将自闭症病人的突变位点引入小鼠中，同样损害了小鼠的发声，这些发现有助于科学家们深入理解Tcf7l2在神经系统中的新功能，为理解人类语言和其相关疾病的发声机制提供了分子遗传的理论基础（图5b-c）。当然，该研究中还存在很多没有解决的问题，例如作为转录因子TCF7L2调控的下游基因有哪些，TCF7L2通过哪些蛋白来协同调控小鼠超声以及对于自闭症病人来说Tcf7l2是否可以作为一个靶点等等，这些问题仍然需要进一步的研究。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41380-023-01993-5
通讯作者简介：贾怡昌教授，清华大学长聘教授，课题组主要关注：1. 内质网离子稳态（ER ion homeostasis）和神经退行性疾病致病的分子机制；2. RNA结合蛋白（RNA binding protein）和pre-mRNA剪接体（spliceosome）功能紊乱在神经退行性疾病发生发展中的重要贡献；3. 应激小体（stress granule）的形成和解聚的分子机制及其中神经退行性疾病中致病机制；4. 哺乳动物发声（vocalization）的分子机制和其在神经疾病中的贡献；5. 基因治疗（gene therapy）在神经疾病中的临床转化研究。以第一作者或通讯作者身份在《Nature》、《Nature Neuroscience》、《Cell》、《Brain》《Cell Research》、《Protein & Cell》和《Molecular Psychiatary》等国际知名学术期刊发表多篇重要学术论文。
学术会议预告【1】会议通知︱小胶质细胞生理与病理功能专题国际研讨会
参考文献（上下滑动查看）
1.Nieder A, Mooney R. The neurobiology of innate, volitional and learned vocalizations in mammals and birds. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2020;375:20190054.2.Tschida K, Michael V, Takatoh J, Han BX, Zhao S, Sakurai K, et al. A Specialized Neural Circuit Gates Social Vocalizations in the Mouse. Neuron 2019;103:459–72 e454.3.Chen J, Markowitz JE, Lilascharoen V, Taylor S, Sheurpukdi P, Keller JA, et al. Flexible scaling and persistence of social vocal communication. Nature 2021;593:108–13.4.Karigo T, Kennedy A, Yang B, Liu M, Tai D, Wahle IA, et al. Distinct hypothalamic control of same- and opposite-sex mounting behaviour in mice. Nature 2021;589:258–63.5.Michael V, Goffinet J, Pearson J, Wang F, Tschida K, Mooney R. Circuit and synaptic organization of forebrain-to-midbrain pathways that promote and suppress vocalization. Elife. 2020;9:e63493.6.S.P. Zhang, P.J. Davis, R. Bandler, P. Carrive. Brain stem integration of vocalization: role of the midbrain periaqueductal gray. J. Neurophysiol., 72 (1994), pp. 1337-13567.U. Jürgens, R. Pratt. Role of the periaqueductal grey in vocal expression of emotion. Brain Res., 167 (1979), pp. 367-3788.R. Bandler, P. Carrive. Integrated defence reaction elicited by excitatory amino acid microinjection in the midbrain periaqueductal grey region of the unrestrained cat. Brain Res., 439 (1988), pp. 95-1069.F.M. Skultety. Mutism in cats with rostral midbrain lesions. Arch. Neurol., 12 (1965), pp. 211-22510.F.M. Skultety. Experimental mutism in dogs. Arch. Neurol., 6 (1962), pp. 235-24111.Fujita E, Tanabe Y, Shiota A, Ueda M, Suwa K, Momoi MY, Momoi T. Ultrasonic vocalization impairment of Foxp2 (R552H) knockin mice related to speech-language disorder and abnormality of Purkinje cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 26;105(8):3117-22.