Cell Death Discov丨骨钙素通过减少β淀粉样蛋白沉积和上调神经胶质细胞糖酵解来改善阿尔茨海默病的认知功能障碍

来源︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”

撰文︱刘建民

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，会导致认知能力逐步下降，其特征包括β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）在大脑中的沉积和脑组织葡萄糖代谢受损[1]。探索该病的发病机制和治疗方法一直是研究的热点。研究显示AD早期就可以观察到脑组织中有氧糖酵解的改变[2]。抑制糖酵解相关主要酶后，人类胎儿星形胶质细胞的胞内胞外Aβ沉积增加，且这些细胞更容易受到Aβ的毒性影响[3]。而增加有氧糖酵解可以改善Aβ诱导的星形胶质细胞活化，并改善AD小鼠的空间认知障碍[4]。因此，靶向神经胶质细胞的糖酵解可能是AD的一种有前景的治疗方法。

骨钙素（osteocalcin，OCN）是一种由成骨细胞特异性分泌的多肽，可通过其代谢活性形式——非羧化骨钙素（ucOCN）发挥多种内分泌功能，同时其在中枢神经系统中的作用正在被研究。OCN可以改善帕金森病小鼠的运动缺陷和多巴胺能神经元丢失[5]。给予老年小鼠外源性OCN或含OCN的年轻小鼠血浆可以改善老年小鼠的认知功能，进一步研究发现G蛋白偶联受体158（Gpr158）是OCN作用于中枢神经系统的受体，用以对抗年龄相关的海马依赖性认知障碍[6]。上述证据表明，OCN对认知能力下降有保护作用。然而，OCN是否能在AD状态下提高认知能力不得而知。

近日，上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌科、上海市内分泌代谢病研究所和上海交通大学BIO-X研究院单畅博士、张登硕士、马冬霓博士，以及杨毓莹博士、李胜天教授和刘建民教授等合作在Cell Death Discovery上发表了题为“Osteocalcin ameliorates cognitive dysfunctions in a mouse model of Alzheimer’s Disease by reducing amyloid β burden and upregulating glycolysis in neuroglia”的研究。该研究发现OCN可以减少脑组织中Aβ沉积，上调神经胶质细胞的糖酵解，从而改善阿尔茨海默病小鼠的认知功能障碍，提示OCN可能作为治疗AD的潜在因子，并为能量调节治疗阿尔茨海默病提供了更多可行性。

研究者通过给APP/PS1转基因AD小鼠每天腹腔注射1μg/kg或10μg/kg OCN 4周后进行行为学实验，分析发现OCN可以改善AD小鼠的焦虑样行为和认知功能障碍。在开放场实验（open field test，OFT）中，AD小鼠进入开放场中心区域的次数和在中心区域的时间较WT小鼠均有减少的趋势，而OCN增加了AD小鼠进入中心区域的次数及在其中的时间（图1A）。在高架十字迷宫实验（elevated plus maze test，EPMT）中，AD小鼠较WT小鼠进入开放臂的次数和处于其中的时间均减少，而OCN显著增加了AD小鼠进入开放臂的次数及相应的时间（图1B）。在明暗穿梭实验（light-dark transition test，LDTT）中，与WT小鼠比较，AD小鼠在明室中的时间显著减少，而OCN可以增加AD小鼠在明室中的时间（图1C）。在Morris水迷宫实验中（Morris water maze test，MWMT），AD小鼠在训练阶段较WT小鼠表现出潜伏期显著增加，而OCN治疗降低了AD小鼠的逃避潜伏期（图1D）。

图1 OCN改善APP/PS1转基因AD小鼠模型的焦虑样行为和认知功能障碍

（图源：Shan C, et al., Cell Death Discovery, 2023）

同时，研究者通过对各组小鼠脑组织切片后进行免疫组化实验后，发现OCN显著降低了AD小鼠海马和皮质中的Aβ沉积。在AD小鼠的海马和皮质中可以观察到明显的淀粉样斑块（图2C），但在WT小鼠中没有观察到（图2A-B）。1μg/kg和10μg/kgOCN可以显著降低AD小鼠海马和皮质中淀粉样斑块的沉积（图2D-E）。

图2 OCN减少APP/PS1转基因AD小鼠的海马和皮质中Aβ沉积

（图源：Shan C, et al., Cell Death Discovery, 2023）

局部场电位（local field potential，LFP）可用于表示神经元网络中的总突触活动，常在哺乳动物中表现出电压振荡。特定的振荡频率与行为功能和神经连接有关[7]。为了研究OCN是否在AD小鼠内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）的突触活动中起作用，研究者在腹腔注射1μg/kg或10μg/kg OCN后观察mPFC的LFP功率变化。在0–200 Hz波段时，1μg/kg OCN改变了AD小鼠的LFP功率，而在WT小鼠中则是10μg/kg OCN改变了WT小鼠的LFP功率（图3A）。并且，1μg/kg OCN显著增加了WT和AD小鼠在High Gamma波段的LFP功率（图3B），但在Ripple波段没有改变（图3C）。而10μg/kg OCN显著增加了Ripple波段的LFP功率（图3E），但在High Gamma波段没有改变（图3D）。

图3 OCN改变APP/PS1转基因AD小鼠mPFC的LFP功率

（图源：Shan C, et al., Cell Death Discovery, 2023）

进一步研究发现，OCN抑制了AD小鼠海马中星形胶质细胞的增殖。越来越多的证据表明，神经胶质细胞（包括星形胶质细胞和小胶质细胞）的激活不仅在神经炎症中起重要作用，而且也是神经退行性变过程中介导Aβ生成、神经元丢失和脑葡萄糖代谢失调的关键因素[8-10]。因此，研究者对小鼠海马中的GFAP和Iba1阳性细胞进行染色，发现AD小鼠中星形胶质细胞显著增殖，而腹腔注射1μg/kg OCN后可显著抑制AD小鼠中的这种现象（图4A，C）。对于小胶质细胞，AD小鼠的海马中Iba1阳性小胶质细胞数量上调，1μg/kg OCN降低了AD小鼠中Iba1阳性的小胶质细胞数量但具有临界效应（图4B，D）。qPCR（图4E-F）中也可以观察到关于GFAP和Iba1表达的类似结果。

图4 OCN抑制APP/PS1转基因AD小鼠海马中星形胶质细胞的增殖

（图源：Shan C, et al., Cell Death Discovery, 2023）

为了进一步探究神经胶质细胞在AD疾病中的作用及其相关机制，研究者进行了一系列体外实验，发现OCN增强了星形胶质细胞的糖酵解能力。Aβ激活星形胶质细胞并损害其能量代谢，主要特征是糖酵解减少[11]。而OCN显著增加了C8-D1A细胞（一种星形胶质细胞系）的葡萄糖消耗（图5A）。此外，OCN处理的C8-D1A细胞培养基中，其乳酸浓度（代表培养细胞的糖酵解活性）升高（图5B），当给药100ng/ml OCN时达到最大乳酸浓度。在此浓度下，研究者使用seahorse实时能量代谢分析仪，发现OCN促进了C8-D1A细胞的最大糖酵解能力（图5C）。同时，细胞的氧化磷酸化水平未受OCN影响（图5D）。Pdk1是增加糖酵解通量的关键酶，Ldha是乳酸生成的关键酶[12,13]。OCN在mRNA和蛋白水平上调Pdk1的表达，同时上调Ldha蛋白水平（图5E-G）。

图5 OCN上调星形胶质细胞的糖酵解水平

（图源：Shan C, et al., Cell Death Discovery, 2023）

Gpr158是OCN调节认知功能的作用受体[6]。基于研究者发现Gpr158在星形胶质细胞中的表达，为了研究OCN对胶质细胞的具体作用机制，研究者通过慢病毒shRNA干扰Gpr158在C8-D1A细胞中的表达来探究OCN是否通过Gpr158来改善糖酵解。在Gpr158蛋白下调56%（图6A，B）的情况下，OCN对葡萄糖消耗和乳酸产生增加的影响被消除（图6C，D）。此外，在Gpr158敲除细胞中，Pdk1的表达下调，并且Pdk1和Ldha的mRNA和蛋白水平在OCN处理情况下没有变化（图6E–G）。

图6 敲减Gpr158后OCN对星形胶质细胞糖酵解的影响被消除

（图源：Shan C, et al., Cell Death Discovery, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究发现OCN可以改善AD小鼠模型中的焦虑样行为和认知功能障碍，同时减轻Aβ沉积，并抑制海马中星形胶质细胞的增殖。此外，OCN改变了AD小鼠内侧前额叶皮层中局部场电位的功率，尤其是增加了高γ波段的LFP功率。体外研究表明，OCN增加了星形胶质细胞和小胶质细胞的有氧糖酵解。敲减星形胶质细胞上Gpr158受体后OCN对胶质细胞糖酵解的影响被消除。该工作为OCN在AD中的神经保护作用提供了机制性见解，为理解骨骼和中枢神经系统之间的交互作用提供了更多证据，为能量调节治疗阿尔茨海默病提供了更多可行性。值得注意的是，本研究并未探讨AD小鼠认知相关脑区中有氧糖酵解是否下调，以及OCN能否改变这一现象及是否通过与受体Gpr158结合在AD中发挥有益作用，这些均有待进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41420-023-01343-y

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本文完