Redox Biol︱澳科大罗婉君团队揭示金丝桃苷通过内质网-线粒体Ca2+信号转导级联减轻阿尔茨海默症Aβ毒性作用机制

撰文︱宋琳琳

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆形式，预计到2050年，痴呆患者的数量将达到1.52亿[1]。目前，科学家们对AD的发病机制提出了多种假说，其中淀粉样蛋白β（Aβ）假说认为淀粉样蛋白生物标志物，是最早发现AD患者神经病理改变的证据[2-4]，除此之外，炎症和代谢功能障碍，以及tau病理学也被认为是AD的可能致病机制[5]，尽管Aβ对AD的作用仍有争议，但对Aβ和磷酸化tau水平的诊断仍是AD临床和研究工作中最经典的方式之一[1]。Aβ肽可以自发地聚集成含β片段的寡聚体和原纤维，这种淀粉样蛋白途径的激活改变了神经元的Ca²⁺信号，导致神经毒性，从而导致神经元细胞的凋亡。在许多亚洲国家，传统的草药植物已被用于抗衰老和调节老年相关症状。作者发现一种跨越血脑屏障的黄酮醇苷-金丝桃苷，来源于药食同源植物山楂，据报道它具有抗抑郁、抗肿瘤和抗病毒的作用，然而，它的神经保护作用仍未得到解释。

近期，澳门科技大学（“澳科大”）中医药质量研究国家重点实验室Neher创新药物发现生物物理实验室罗婉君课题组在Redox Biology上发表了题为“Hyperoside alleviates toxicity of β-amyloid via endoplasmic reticulum-mitochondrial calcium signal transduction cascade in APP/PS1 double transgenic Alzheimer's disease mice”的研究论文，揭示了金丝桃苷通过调节内质网-线粒体Ca²⁺信号转导级连级联反应来调节Aβ诱导的神经毒性作用机制，研究表明金丝桃苷可以作为阿尔茨海默病的潜在治疗剂或预防性补救措施。

首先作者研究了金丝桃苷与Aβ的结合情况。金丝桃苷（Hyperoside，HYP）的结构式如图1A。图1B通过BatchMin V13.2预测了Aβ与HYP之间的结合能为-8.9 kcal/mol。Aβ聚集体的形成及其颗粒大小通过DLS验证（图1C）。其中Aβ单体的平均粒径为365.62nm，但Aβ聚集体的粒径为1877nm（图1D）。然后使用ThT荧光检测法对Aβ聚集体进行检测。如图1E所示，HYP减少了Aβ的纤维化和聚集。HYP与Aβ聚集体的直接结合亲和力通过BLI试验得到证实（图1F-1G）。这些数据通过光谱学和化学方法证实了HYP与Aβ的结合倾向。

图1 HYP与Aβ的结合倾向验证

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

在进一步研究HYP在体内的药理作用之前，作者对HYP进行了系统的药代动力学研究（图2）。血脑屏障（BBB）严格控制着各种物质从血液到大脑的运输，因此很多疗效好的药物在治疗脑部疾病时，由于其BBB通透性低，能到达目标脑区的治疗浓度低而无效。因此，采用鼻腔给药法对小鼠进行给药，证实了HYP通过鼻腔给药具有相对较低的侵袭性和易操作性，并且可以绕过BBB，提高药物的脑内生物利用度，此外，根据HYP的半衰期值，在随后的所有动物实验中，通过鼻腔给药的方式，确定了每3天一次的给药间隔。

图2 HYP的代表性色谱图和药代动力学参数

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

AD最明显的特征是由神经元和突触损伤引起的认知功能的逐步下降。接下来通过Y型迷宫自发交替测试，以评估HYP治疗后的学习和短期空间记忆能力。通过测量恐惧条件反射试验中的冻结反应，评估了基于杏仁核-海马体（恐惧回路中参与情绪记忆形成和存储的主要大脑结构）和依赖海马体环境性恐惧触发的学习能力。最后，通过转棒试验来检验小鼠的平衡和协调能力。这些行为学数据证实，HYP可以改善APP/PS1小鼠的学习和空间记忆以及运动能力（图3）。

图3 HYP对APP/PS1小鼠空间工作记忆和海马记忆衰退的影响

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

接下来作者评估了HYP对Aβ诱导的细胞死亡的影响。首先，对HYP处理后的HT22细胞的生存能力进行评价，如图4A所示，在单独使用HYP时，在测试浓度范围内没有观察到明显的细胞毒性。虽然聚集的Aβ诱导HT22细胞死亡，但HYP与聚集的Aβ共同处理后，细胞活力以剂量依赖的方式增加（图4B-4C）。证明HYP在Aβ诱导的神经元细胞死亡中的保护作用。

图4 HYP对Aβ聚集物诱导的HT22细胞凋亡的影响

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

尽管AD的潜在机制仍存在争议，但越来越多的证据表明钙(Ca²⁺)是调节AD发病机制的重要因素[6]，Aβ聚集体诱导的神经毒性也与神经元内Ca²⁺失衡有关[7]。如图5A和5B所示，BAPTA/AM能够降低Aβ诱导的细胞死亡。然后通过FLIPR Tetra高通量细胞筛选系统测量实时动态Ca²⁺水平。如图5C-5D所示，表明Aβ和HYP均能够通过细胞内钙通道调节Ca²⁺水平。随后如图5E所示，HYP-Aβ复合物与RyR2（PDB代码：5G0A）进行分子对接，值得注意的是，虽然HYP-Aβ复合物与RyR2结合良好，但单独的HYP不与RyR2结合。接下来通过siRNA敲低实验进一步研究了RyR2的作用，图5F-5H显示，HYP依然可以在一定程度上恢复HT22/RyR2 Si细胞中Aβ诱导的Ca²⁺水平紊乱。这些结果表明，HYP通过调节RyR2缓解了由Aβ聚集体诱导的Ca²⁺稳态失衡。

图5 HYP通过RyR2调节Aβ诱导的Ca²⁺平衡失调

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

RyR2通道涉及许多细胞功能，尤其是线粒体代谢。因此，作者进一步验证了HYP对Aβ诱导的内质网-线粒体Ca²⁺信号传导与细胞凋亡的调节作用。通过实时测量细胞中线粒体膜电位，表明HYP减弱了由Aβ触发的膜电位降低（图 6A）。除此之外，通过LC-MS/MS对ATP含量进行检测，证明HYP缓解了Aβ诱导的线粒体ATP减少（图 6B）。总的来说，这些结果表明：HYP通过调节内质网-线粒体Ca²⁺水平及其相关的信号转导级联减少Aβ诱导的神经细胞凋亡。

图6 HYP对Aβ诱导的线粒体膜电位丧失的调节作用

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

图7 HYP通过内质网-线粒体Ca²⁺调控Aβ毒性的机制图

（图源：Song, LL. et al.,Redox Biology, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，在这项研究中，研究者使用Aβ聚集体形式的混合物来建立AD细胞毒性模型。有趣的是，HYP降低了Aβ寡聚体和原纤维的蛋白水平，但对Aβ单体的水平没有影响，这可能有利于维持Aβ的正常生理功能。与AD的早期表现一致[8]，在体外研究中发现Aβ聚集体可诱导细胞内钙失调，位于海马体和皮层的RyR2可介导Ca²⁺释放并导致Aβ斑块的形成[9]，Aβ可以反过来激活RyR2通道以促进Aβ的产生，从而进一步增强RyR2泄漏并导致恶性循环[10]。Aβ诱导的Ca²⁺过载导致过量Ca²⁺流入线粒体，线粒体是钙的主要缓冲系统，这种钙过载随后导致膜电位降低以及细胞色素c的释放[11]。此外，RyR2的敲低伴随着MCU的mRNA水平表达降低，这可能是HYP调节Ca²⁺稳态的原因。然而，RyR2表达的过度减少也会导致对神经元功能的不利影响[12, 13]，因此，控制开放时间而不是阻断RyR2的功能和表达可能是通过RyR2调节AD的更安全的方法。HYP通过鼻腔给药后减少了APP/PS1小鼠海马中的斑块沉积，并改善了CA1和CA3区的神经元细胞损伤。尽管这种有益效果可归因于HYP调节RyR2的基因水平，但仍需要更多的体内实验来验证。最后，与静脉给药相比，鼻腔给药导致大脑中HYP蓄积量更高。因此，HYP鼻腔给药具有易操作和高血脑屏障渗透性的优点，可以进一步开发为用于预防和治疗AD的鼻用制剂

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102622

博士生宋琳琳为论文第一作者，罗婉君副教授为通讯作者，其余参与作者均为澳门科技大学中医药质量研究国家重点实验室Neher创新药物发现生物物理实验室在读研究生。该工作得到了澳门科学技术发展基金的支持。             通讯作者罗婉君（左），第一作者宋琳琳（右）（照片提供自：罗婉君团队）

通讯作者简介（上下滑动查看）  

罗婉君博士，长期专注于中药自噬活性药理、抗衰老及神经保护机理研究，为抗衰老及神经退行性疾病药理调控机制提供创新用药新方案及靶点。近年研究领域及成果集中聚焦于: (1) 研发用于加速降解引发神经退行性疾病致病蛋白的创新自噬天然活性成分，并减轻其神经毒性; (2) 应用结合高效液相色谱及生物层干涉光学测量分析技术，从复杂中药成分中找出靶向结合β-淀粉样蛋白及抗衰老的有效成份; (3) 积极开发诱导自噬凋亡作用的创新型自噬天然小分子，为耐药癌细胞中诱导自噬性细胞死亡的药物创新研发提供新线索。在此领域上，于知名SCI期刊包括Pharmacology and Therapeutics、Pharmacological Research、Signal Transduction and Targeted Therapy， EBioMedicine， Redox Biology、Cell Death & Diseases、Molecular Cancer Therapeutics、Antiviral Research、Pharmaceuticals，Phytomedicine、Scientific Reports、Oncotarget 等发表第一或通讯作者身分SCI研究论文20多篇。同时，于多个学术期刊包括Pharmacological Research、Molecules 及Heliyon等担任编辑。

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[1] P. Scheltens, B. De Strooper, M. Kivipelto, et al. Alzheimer's disease, Lancet 397(10284) (2021) 1577-1590 https://doi.org/10.1016/s0140-6736(20)32205-4[2] S. Salloway, M. Farlow, E. McDade, et al. Nat Med 27(7) (2021) 1187-1196 https://doi.org/10.1038/s41591-021-01369-8[3] H. Matzkin, J. Chen, R. Agai, et al. Long-term biochemical progression-free survival following brachytherapy for prostate cancer: Further insight into the role of short-term androgen deprivation and intermediate risk group subclassification, PLoS One 14(4) (2019) e0215582 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215582[4] P.J. Visser, F. Verhey, D.L. Knol, et al. Prevalence and prognostic value of CSF markers of Alzheimer's disease pathology in patients with subjective cognitive impairment or mild cognitive impairment in the DESCRIPA study: a prospective cohort study, Lancet Neurol 8(7) (2009) 619-27 https://doi.org/10.1016/s1474-4422(09)70139-5[5] The Need for Early Detection and Treatment in Alzheimer's Disease, EBioMedicine 9 (2016) 1-2 https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2016.07.001[6] F.M. LaFerla, Calcium dyshomeostasis and intracellular signaling in Alzheimer's disease, Nat Rev Neurosci 3(11) (2002) 862-72 https://doi.org/10.1038/nrn960[7] M. Calvo-Rodriguez, S.S. Hou, A.C. Snyder, E.K. Kharitonova, A.N. Russ, S. Das, Z. Fan, A. Muzikansky, M. Garcia-Alloza, A. Serrano-Pozo, E. Hudry, B.J. Bacskai, et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease, Nat Commun 11(1) (2020) 2146 https://doi.org/10.1038/s41467-020-16074-2[8] K.V. Kuchibhotla, S.T. Goldman, C.R. Lattarulo, et al. Abeta plaques lead to aberrant regulation of calcium homeostasis in vivo resulting in structural and functional disruption of neuronal networks, Neuron 59(2) (2008) 214-25 https://doi.org/10.1016/j.neuron.2008.06.008[9] T. Furuichi, D. Furutama, Y. Hakamata, et al. Multiple types of ryanodine receptor/Ca2+ release channels are differentially expressed in rabbit brain, J Neurosci 14(8) (1994) 4794-805 https://doi.org/10.1523/jneurosci.14-08-04794.1994[10] A. Lacampagne, X. Liu, S. Reiken, et al. Post-translational remodeling of ryanodine receptor induces calcium leak leading to Alzheimer's disease-like pathologies and cognitive deficits, Acta Neuropathol 134(5) (2017) 749-767 https://doi.org/10.1007/s00401-017-1733-7[11] P. Korge, H.M. Honda, J.N. Weiss, Protection of cardiac mitochondria by diazoxide and protein kinase C: implications for ischemic preconditioning, Proc Natl Acad Sci U S A 99(5) (2002) 3312-7 https://doi.org/10.1073/pnas.052713199[12] J. Yao, B. Sun, A. Institoris, et al. Limiting RyR2 Open Time Prevents Alzheimer's Disease-Related Neuronal Hyperactivity and Memory Loss but Not β-Amyloid Accumulation, Cell Rep 32(12) (2020) 108169 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108169[13] J. Yao, Y. Liu, B. Sun, et al. Increased RyR2 open probability induces neuronal hyperactivity and memory loss with or without Alzheimer's disease-causing gene mutations, Alzheimers Dement (2022) https://doi.org/10.1002/alz.12543

本文完