STAR Protocols︱南昌大学李海星团队发表基于腕表PCR基因组步移获取未知侧翼DNA的实验方案

撰文︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”

撰文︱王凌琴，李海星

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

基因组步移（Genome-walking）是一种获取未知侧翼DNA的技术，已成为分子生物学及相关领域不可或缺的一部分[1,2]。最早的步移技术基于繁琐的基因组文库构建与筛选；随后逐步发展出了简单、快速且可靠的PCR基方案[3,4]。PCR方法种类繁多，但依据原理总体上可以分为三类：（1）反向PCR；（2）连接介导的PCR；（3）随机引发PCR。前两类技术涉及限制酶切割和连接步骤。随机引发PCR则无需在扩增前对模板进行任何处理，但其步移效率和非特异性背景仍有待改进[5-8]。

近日，南昌大学中德联合研究院李海星研究员课题组在Cell子刊STAR Protocols杂志在线发表了题为“Protocol to access unknown flanking DNA sequences using Wristwatch-PCR for genome-walking”的实验方案文章（Protocol）。该方案设计了三条步移引物即腕表引物（Wristwatch primer，WWP），其3’端的12 bp和5’端的3 bp序列一致，而中间10 bp则两两之间完全错配。因此，仅在温度足够低的情况下，一条WWP才能退火至另一WWP的互补序列，并形成一种能选择性地富集侧翼序列的腕表样结构。该方法因此被称为腕表PCR（Wristwatch PCR）。通过调取微生物和水稻已知基因的侧翼序列，验证了方法的可行性。腕表PCR可成为现有基因组步移技术的替代方案。

该研究设计了一套共3条WWP，其特征是每两条WWP之间具有相同的5’端（12bp）和3’端（3bp），以及错配的中心区域（10bp）（表1）。任意两条WWP只能在低温退火，并形成腕表样结构。三条WWP因使用顺序不同，可形成三组不同的引物组合（表2）。在每次步移实验中，三个WWP组合分别与一套巢式特异性引物配对，平行进行三组WW-PCR扩增。每组WW-PCR包括三轮（一级、二级、三级）巢式扩增，分别由该WWP组合顺序配对巢式特异性引物进行。

表1本研究使用的腕表引物。注：WWP是指Wristwatch primer即腕表引物

（表源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

表2 腕表引物组合及其与特异性引物组的配对。注：WWP是指Wristwatch primer即腕表引物；GSP是指gene-specific primer即基因特异性引物

（表源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

每轮WWP-PCR执行一个低严谨型循环，以促使WWP在基因组模板上任意退火，或定向退火至前一轮扩增子的WWP位点，从而合成一个单链DNA（ssDNA）池。其中，目标ssDNA的3′末端为特异性引物（GSP）的互补序列，5’末端为WWP序列；在随后的一个高温循环中，GSP退火至其位于3′末端的互补区，延伸得到一条两端分别为完整的GSP和WWP的双链；在剩余的高温循环中，该双链呈指数扩增。非目标ssDNA因不存在任何引物的完整退火位点而不能被扩增。经过三轮巢式PCR，可有效地富集目标产物，同时消除非特异性背景。WWP-PCR的原理和实验步骤如下（图1，2）,一般仅需两轮PCR，即可得到目的条带。该方法完全基于PCR扩增，且WWP对任何基因组通用。

图1 腕表PCR原理图

（图源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

图2 腕表PCR方案流程图

（图源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

为了验证WW-PCR的可行性，用其分离短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因和水稻潮霉素的侧翼序列。结果表明，每个WW-PCR获得的清晰条带均为目标产物，且每次可步移达4 kb，显示出方法的高特异性和高效率。一些WW-PCR产生了多条DNA带，这是由于初级WWP在低退火循环中部分退火到了未知区域上的多个位点。由于巢式GSP之间的位置关系，二级扩增产物略大于三级产物（图3）。

图3 腕表PCR基因组步移验证结果

（图源：Wang LQ, et al., STAR Protoc, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究描述了一种基于步移引物之间形成的腕表结构以获取未知侧翼的PCR方案。该方案详细描述了步移引物和序列特异性引物的设计标准，腕表引物的排列组合，使用巢式扩增分离目标DNA的实验程序。该方案同时提供了实验过程中的注意事项与常见问题解决办法。我们正在思考降低多条带扩增并提高步移效率的方案。WW-PCR可以用于转基因整合位点识别、新遗传资源获取与微生物筛选等方面。

原文链接：http://doi.org/10.1016/j.xpro.2022.102037

通讯作者：李海星（左）；第一作者：王凌琴（右）

（照片提供自：李海星实验室）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

李海星，博士，研究员，博士研究生导师，南昌大学赣江特聘教授、江西省主要学科学术与技术带头人领军人才，江西省青年科学家培养对象，江西省杰出青年科学基金获得者，江西省优秀博士学位论文获得者，食品科学与技术国家重点实验室固定研究人员，江西省优秀硕士论文指导教师；主要从事微生物工程方面的研究，主持省部级或以上项目10余项，发表SCI论文20余篇，参与编写专著2部，获江西省自然科学奖三等奖2项，广东省科技进步奖二等奖1项。

欢迎加入逻辑神经科学群：文献学习2

扫码添加微信，并备注：逻辑-文献-姓名-单位-研究领域-学位/职称


往期文章精选新刊启航，欢迎投稿科研学习课程精选

学术会议预告

参考文献（上下滑动查看）  

[1] Ashrafmansouri SS, Kamaladini H, Haddadi F, et al. Simple innovative adaptor to improve genome walking with convenient PCR. J. Genet. Eng. Biotechnol. 2020. 18: 64.

[2] Sun T, Jia M, Wang L, et al. DAR-PCR: a new tool for efficient retrieval of unknown flanking genomic DNA. AMB Express. 2022. 12: 131.

[3] Myrick KV, Gelbart WM. Universal fast walking for direct and versatile determination of flanking sequence. Gene. 2022. 284: 125-131.

[4] Zeng T, Zhang D, Li Y, et al. Identification of genomic insertion and flanking sequences of the transgenic drought-tolerant maize line "SbSNAC1-382" using the single-molecule real-time (SMRT) sequencing method. PLoS One. 2020. 15: e0226455.

[5] Ochman H, Gerber A, Hartl D. Genetic applications of an inverse polymerase chain-reaction. Genetics. 1988. 120: 621-623.

[6] Rosenthal A, Jones D. Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1990. 18: 3095-3096.

[7] Liu Y, Whittier R. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from PI and YAC clones for chromosome walking. Genomics. 1995. 25: 674-681.

[8] Chang K, Wang Q, Shi X, et al. Stepwise partially overlapping primer-based PCR for genome walking. AMB Express. 2018. 8: 77.

本文完