Science︱突破！孤儿G蛋白偶联受体GPR158作为一种代谢甘氨酸受体:mGlyR

撰文︱金梦迪

责编︱王思珍，方以一

甘氨酸是一种抑制性神经递质，但它在发育中的神经元中的作用可能是兴奋性的[1]，但尚未发现介导这些作用的受体。神经系统中的代谢神经调控通常由G蛋白偶联受体（G Protein-coupled receptors，GPCRs）通过激活异三聚体G蛋白转导信号实现[2]。G蛋白信号调节蛋白（regulator of g protein signaling protein，RGS）可促进其G蛋白信号失活[3]。GPCRs介导除甘氨酸和牛磺酸以外的所有主要神经递质的作用。然而，许多GPCR仍然没有确定的内源性配体。GPR158是大脑中最丰富的孤儿GPCRs之一，通过与RGS蛋白偶联来转导信号[4]。在神经元中，它调节向第二信使腺苷3',5' -单磷酸（cAMP）的信号传递，并控制关键离子通道、激酶和神经营养因子参与神经元兴奋性和突触传递[5]。因此，GPR158与认知和情感状态密切相关[6]。而GPR158的内源性配体仍然未知，GPR158最近的结构揭示了细胞外缓存域的存在，这是一种假定的配体结合模块。

2023年3月30日，佛罗里达大学斯克里普斯生物医学研究所Kirill A. Martemyanov教授团队在Science上发表题为“Orphan receptor GPR158 serves as a metabotropic glycine receptor: mGlyR”的研究论文。该研究鉴定出一种孤儿G蛋白偶联受体GPR158作为代谢型甘氨酸受体，他们将其命名为mGlyR。甘氨酸和相关的调节剂牛磺酸直接结合到GPR158的Cache结构域上，抑制了与受体相关的G蛋白信号7-G蛋白β5 (RGS7-Gβ5)的胞内信号复杂调节器的活性。甘氨酸通过mGlyR信号抑制cAMP的产生。这项研究表明甘氨酸，而不是牛磺酸，通过mGlyR调节皮层神经元的兴奋性。这些结果确定了一个主要的神经调节系统参与调节甘氨酸的代谢作用，对理解认知和情感状态具有意义。

一、甘氨酸信号通过GPR158调节cAMP

这项研究发现GPR158 Cache域有一个小口袋，其结构与其他Cache域的氨基酸结合口袋相似（图1A)。该研究手下假设GPR158可能存在氨基酸配体，并筛选了一个氨基酸库以了解它们改变GPR158介导的信号传导的能力。由于GPR158与大脑中cAMP的调节有关，研究使用了基于生物发光共振能量转移（BRET）的cAMP生物传感器(图1B）。在所有测试的氨基酸中，当应用于表达GPR158的人胚胎肾(HEK) 293细胞时，相对于未转染的细胞，只有甘氨酸的cAMP显著降低（图1C）。动力学模式下的个体反应分析显示，甘氨酸应用于表达GPR158的U87胶质母细胞瘤细胞可导致cAMP降低，在缺乏GPR158的细胞中未观察到甘氨酸诱导的cAMP变化（图1D和E）。 而GPR158的这种抑制作用通过共表达RGS7-G蛋白β5（RGS7-Gβ5）进一步增强，这表明GPR158信号通过该蛋白复合物影响cAMP水平（图1D和E）。该研究还进一步测试了牛磺酸的效果，发现牛磺酸仅在表达GPR158的HEK293细胞中引起cAMP水平的显著降低，牛磺酸对GPR158介导的cAMP抑制的作用却弱于甘氨酸。

图 1 甘氨酸作为GPR158配体的鉴定。

（图源：Laboute T,et al., Science, 2023）

二、甘氨酸抑制GPR158对RGS7-Gβ5的调控

RGS7-Gβ5是已知的Gαi/o蛋白的鸟苷三磷酸酶（GTPase）激活蛋白（GAP)，可调节cAMP的产生。该研究进一步探讨了GPR158与RGS7-Gβ5的相互作用。简单来说，通过GPCR刺激激活G蛋白，在释放的Venus-Gβγ亚基与masGRK3CT-Nluc报告蛋白相互作用时产生BRET信号。当GPCR拮抗触发Gα失活并与Venus-Gβγ重组形成非活性异源三聚体时，该信号被猝灭。研究发现，引入RGS7-Gβ5可以加速其底物Gαo的失活，并且应用甘氨酸对基线Gαo失活或RGS7-Gβ5辅助过程没有影响（图2B和D）。然而，当GPR158与RGS7-Gβ5共表达时，甘氨酸显著减缓了Gαo失活（图2,C和D），这表明它通过接合GPR158特异性地抑制了RGS7-Gβ5的GAP活性。剂量效应研究表明，甘氨酸对GPR158的中位抑制浓度（IC50）为3 μM（图2E）。牛磺酸仅在共表达GPR158和RGS7-Gβ5的细胞中表现出类似的抑制Gαo失活的作用，但其IC50较低，约为6 μM（图2B-E)。

图2 甘氨酸和牛磺酸可减缓GPR158-RGS7-Gβ5复合物对Gαo的失活。

（图源：Laboute T,et al., Science, 2023）

三、GPR158直接结合甘氨酸

为了确认GPR158是甘氨酸的直接靶点，该研究首先设计了一种基于流式细胞术的检测方法来监测异硫氰酸荧光素（FITC）偶联甘氨酸与表达GPR158的细胞的结合（图3A）。当表达GPR158的HEK293细胞与FITC -甘氨酸孵育时，观察到大量细胞被标记（图3B）。当FITC -甘氨酸与未转染GPR158的细胞孵卵时，没有明显的标记。剂量反应研究进一步证实了这种结合及其在所用甘氨酸范围内的选择性（图3C）。

放射性配基滴定实验检测到饱和[3H]甘氨酸与含有GPR158的膜的结合显著过量，而与不含GPR158的膜的线性非特异性结合（图3D,E）。Scatchard分析估计甘氨酸GPR158的解离常数KD约为3 μM（图3F）。结合竞争实验直接比较甘氨酸和牛磺酸取代与GPR158结合的[3H]甘氨酸的能力，证实了甘氨酸和牛磺酸与GPR158结合的特异性，也揭示了牛磺酸相对于甘氨酸的亲和力低两倍。此外，等温滴定实验表明，甘氨酸加入GPR158后释放的热量饱和，在新鲜样品中，KD从2到16 μM不等(图3 G-I）。直接结合实验中获得的甘氨酸的亲和力与功能GAP测定的亲和力一致，表明与甘氨酸的结合是GPR158活性变化的原因。

图3 甘氨酸与GPR158的直接相互作用。

（图源：Laboute T,et al., Science, 2023）

四、甘氨酸与GPR158的Cache结构域结合，调控RGS7-Gβ5复合物的GAP活性

随后研究者进行了分子对接实验，将甘氨酸拟合到GPR158 Cache域假定的配体结合口袋模型中（图4A)。对于得分最高的甘氨酸形态，可以很好地容纳在一个口袋中，在那里它可以通过与S172、R173、E271和D307侧链的氢键相互作用网络来稳定，带电荷的侧链理想地定位于稳定两性离子的羧酸和胺部分。这些残基嵌在其他亲水残基的网状结构中，分布在邻近区域（图4B）。为了测试在GPR158缓存域中形成假定的甘氨酸口袋的残基的作用，该研究进行了位点定向突变。在放射性配体结合实验中，R173A、E271A和Y269A突变体显示[3H]甘氨酸结合几乎完全缺失，证实了这些残基在配体配位中的重要作用（图4B）。随后每个突变体进行了功能测试（图4C和D）。提示每个甘氨酸结合缺陷的突变体也失去了抑制RGS7-Gβ5 GAP活性的能力（图4E)。

图 4. 作为配体结合位点探测GPR158的Cache域。

（图源：Laboute T,et al., Science, 2023）

五、甘氨酸通过GPR158调节神经元兴奋性

最后，该研究评估了甘氨酸调制GPR158对神经元活动的影响。为了分离代谢作用，研究者用药物阻断来对抗兴奋性和抑制性突触驱动，并测量电流-电压关系对去极化电流斜坡的响应。甘氨酸的应用显著增加了动作电位的数量，同时降低了引起第一个动作电位所需的电流（图5 A-C），而静息膜电位没有变化。甘氨酸的这种兴奋作用不同于其典型的抑制作用介导的甘氨酸受体（GlyR)离子通道。为了证实GPR158参与甘氨酸的作用，这样研究还构架了GPR158敲除（GPR158 KO)小鼠模型。结果显示，应用甘氨酸未能改变Gpr158 KO小鼠前额叶皮层II层和III层神经元的兴奋性（图5 D至F）。这些实验揭示了甘氨酸通过GPR158调节神经元兴奋性。

图 5. 甘氨酸对神经元兴奋性的影响。

（图源：Laboute T,et al., Science, 2023）

图 6. 甘氨酸作用于mGlyR的机制示意图。

（图源：Laboute T,et al., Science, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

这项研究提供的证据表明，GPR158是甘氨酸的代谢受体，建议将其命名为代谢甘氨酸受体（metabolic glycine receptor，mGlyR）。mGlyR（GPR158）信号在甘氨酸或牛磺酸结合上偏离GPCRs的典型作用的机制。mGlyR不是激活G蛋白，而是招募一个RGS7-Gβ5复合体，将其对接到典型GPCRs用于与G蛋白相互作用的胞内口袋中，并将配体结合后7跨膜结构的变化传递到Gα的构象变化中，触发核苷酸交换。因此，在这项研究提出的模型中（图5H），甘氨酸与mGlyR的Cache结构域结合改变了细胞内表面的构象，进而影响RGS7-Gβ5的构象。这种变化降低了RGS7-Gβ5刺激Gα GTPase的能力，可能是通过不利于其对膜的取向。从这个意义上说，甘氨酸通过降低GPR158-RGS7-Gβ5复合物的活性来充当其拮抗剂。因此，甘氨酸信号通过mGlyR抑制抑制G蛋白的调节，从而产生兴奋性影响。这一调控使代谢甘氨酸能系统具有一个明显的特征，即其影响程度与其他GPCR级联激活Gi/o的程度相关，其影响随着Gi/o输入的增加而增加。这项研究的发现为探索甘氨酸的代谢影响及其在神经系统生理学中的作用开辟了许多有趣的途径，在完整的神经回路的背景下，甘氨酸可能触发更复杂的反应，可能涉及离子型和代谢性系统之间的相互作用。此外，研究者认为通过mGlyR进行的甘氨酸能信号传递对理解情绪障碍和开发新的药理学策略具有意义。mGlyR在内侧前额叶皮层（mPFC）显著表达[4]，而这是一个与抑郁症密切相关的区域[7]。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.add7150

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【3】会议通知︱2023年成瘾与脑科学国际研讨会暨中国药物滥用防治协会成瘾与脑科学分会第一届学术会议（2023年4月9-10日，深圳）【4】会议通知︱2023中国衰老科学大会第一轮通知（2023年4月21-23日，北京）【5】会议通知︱中国神经科学学会神经影像学分会2023学术年会（2023年5月19-21日，广州）【6】学术会议预告︱Novel Insights into Glia Function & Dysfunction（2023年4月24-28日，日本）【7】会议通知︱第六届中国神经科学学会神经退行性疾病分会年会会议通知（2023年4月7-9日，湖南长沙）          参考文献（上下滑动查看）  

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编辑︱王思珍
本文完