Science︱重磅！胞内抗体TRAM21介导小鼠模型中tau蛋白免疫治疗的有效性

撰文︱徐琳子责编︱王思珍，方以一(标题中TRAM21校改为TRIM21)

常见的神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病，均可表现为胞质内过度磷酸化tau的聚集[1]。针对tau抗体（antibodies，Abs）的被动免疫可以减少动物模型中的tau病理，正被作为疾病修饰疗法研究[2]。这种保护作用的机制仍然不明确，推测的机制可能包括：利用细胞表面Ab受体、Fc-γ受体（FcγRs）的小胶质细胞内吞作用[3-5]，阻断tau蛋白种子进入细胞以及溶酶体降解。胞质Ab受体和E3 泛素连接酶TRIM21（The cytosolic Ab receptor and E3 ubiquitin ligase，T21）可与胞内Ab结合颗粒（Ab-bound particles）结合，并在蛋白酶体上产生强大的降解反应[6]。细胞实验发现，将Abs引入细胞可以诱发多种蛋白发生T21依赖的选择性降解，包括tau蛋白[7]。然而，T21对tau病理学免疫治疗保护作用的贡献仍未确定。

2023年3月30日，剑桥大学英国痴呆症研究所的William A McEwan团队在Science上发表了题为“Cytosolic antibody receptor TRIM21 is required for effective tau immunotherapy in mouse models”的文章，作者使用多种细胞和动物模型系统，T21可以在针对tau病理的Ab保护中发挥作用。Tau-Ab复合物被内化到神经元的细胞质中，这使得T21能够参与并阻断种子聚集。Ab介导的针对tau病理的保护作用在缺乏T21的小鼠中丢失。因此，胞质提供了一个免疫治疗保护的位点，这可能有助于神经退行性疾病中基于Ab疗法的设计。

为了研究tau种子聚集是否可能被T21阻断，作者首先评估了Abs是否可以作为tau聚集复合物被带入神经元中。作者将重组的tau与BR134孵育，BR134是一种针对tau C末端的兔多克隆Ab，可以中和人类细胞系中的种子tau聚集。8小时后，无论是否存在Ab，在神经元内都观察到tau聚集，这表明BR134不会阻止它们的摄取（图1A和B）。当BR134存在时，这些细胞内tau复合物与T21共定位，T21位于细胞质中。T21阳性细胞tau复合物的数量在8小时内增加，这与tau进入神经元细胞质的动力学一致（图1C）。T21的二聚体通过T21 PRYSPRY结构域和Ab Fc区域之间的相互作用结合Abs [8]。作者使用荧光各向异性在BR134和小鼠T21 PRYSPRY结构域的背景下证实了这种相互作用，并观察到单体解离常数（Kd）为19 nM（图1D）。因此，tau与抗体复合物可进入神经元的细胞质，并通过Ab Fc区域和T21 PRYSPRY结构域之间的高亲和力相互作用募集T21。

图1 神经元培养物中Ab的保护机制。

（图源：Mukadam, Aamir S, et al., Science, 2023）

接下来，作者研究了T21是否有助于中和种子tau聚集体。作者使用器官型海马切片培养（OHSC）播种模型。切片由表达额颞叶变性相关突变P301S（P301S Tau-Tg）的人源性tau转基因小鼠制备，并在气液界面培养（图1E）。作者还在相同的tau背景（P301S Tau-Tg T21^−/−）上制备了T21缺陷小鼠系的切片。来源于两种基因型的OHSC保留了中枢神经系统主要细胞类型的正常代表，来自T21^−/−动物的OHSC不表达免疫印迹可检测到的T21。OHSCs在培养中将tau保持在天然状态超过8周，并且基因型在响应重组tau时显示出相似的种子聚集水平。然而，在基因型之间观察到的BR134中和水平存在显着差异（图1F和G）。与对照Abs相比，BR134在T21^−/− OHSC中减少了>90%的播种。然而，T21的基因缺失几乎完全消除了BR134阻止种子聚集的能力。

接下来，作者研究了Abs和T21的活性是否可以抑制由于OHSC中的种子聚集而发生的种子能力tau物种的形成。如上所述，作者在存在和不存在BR134的情况下用重组tau处理OHSC。3周后检查OHSC匀浆在敏感报告细胞系[人胚胎肾（HEK）293 P301S tau-venus]上的种子感受态物种水平。未经处理的OHSC仅含有低水平的tau，而用tau处理的OHSC诱导了大量水平的tau聚集（图1H）。作者观察到与对照Abs相比，用BR134处理的tau显着减少，但仅在存在T21时。在P301S tau-Tg T21^−/− OHSCs中，Abs无法减少产生的tau数量。T21通过其E3连接酶活性促进病毒中和，并刺激泛素-蛋白酶体系统的参与蛋白降解。为了测试接种中和是否需要这种活性，作者使用了TAK-243，UBA1的抑制剂，一种E1泛素激活酶，它阻止了原代神经元中的多泛素化。使用抑制剂时，不再观察到tau种子的中和（图1I）。因此，Abs将T21募集到内化的tau中，抑制种子能力tau 的形成，并降低过度磷酸化tau复合物的水平。

图2 FcγR在OHSC中的贡献和T21在人iPSC衍生的神经元中的贡献。

（图源：Mukadam, Aamir S, et al., Science, 2023）

Abs可与FcγR相互作用通过促进小胶质细胞对tau的摄取来介导细胞外保护。因此，作者研究了FcγR相互作用在预防OHSCs种子聚集方面的贡献。使用小鼠单克隆Ab，抗pS422 tau（AP422），它与S422磷酸化的tau结合，可用于检测阿尔茨海默病、皮质基底节变性和进行性核上性麻痹脑制备的tau。与BR134一样，AP422可防止OHSC中种子感受态物种的播种和生成，这两者都依赖于T21（图2A和B）。为了实现Ab Fc区域的反向遗传诱变，克隆AP422并表达为重组小鼠免疫球蛋白G2a（IgG2a）（rAP422）。通过PGLALA取代消除Ab与小鼠FcγRI、FcγRIIB、FcγRIII和FcγRIV的相互作用，但维持T21和FcRn相互作用，使用重组小鼠IgG2a作为对照。正如预期的那样，在不表达FcγR的HEK293细胞中，rAP422野生型（WT）与rAP422-PGLALA的中和之间没有差异（图2C）。在存在小胶质细胞的OHSC中，rAP422-PGLALA能够发挥与未修饰的rAP422-WT相似的保护水平，只有一小部分活性丧失（图2D）。这与T21缺失形成鲜明对比，T21缺失几乎完全丢失了中和。因此，通过T21进行的细胞内中和主要负责阻断AP422在离体脑切片培养物中接种tau。

神经退行性疾病中tau免疫治疗的一个重要考虑因素是人类神经元中T21的水平和活性，这是阿尔茨海默病和许多其他tau病中tau表达和聚集的主要部位。作者使用人类诱导的多能干细胞（iPSC）来检查在这种情况下T21是否可用于Ab介导的tau降解。免疫印迹证实T21在人iPSC中表达，并通过干扰素-α（IFNα）处理上调，IFNα是一种已知调节T21表达的细胞因子（图2E）。作者使用在神经元特异性启动子控制下表达绿色荧光蛋白5型腺病毒载体（AdV-hSyn-GFP）的中和来确定T21活性。小鼠单克隆Ab 9C12以T21依赖性方式治疗AdV感染，T21结合界面处的Fc氨基酸取代H433A可以逆转感染。使用具有人Fc区（rh9C12）的9C12的嵌合小鼠-人变体，作者观察到人类神经元中AdV感染的有效中和（图2F）。然而，具有点突变H433A的rh9C12几乎完全无法中和感染。因此，T21在人类神经元中活跃表达，并且T21通路可用于免疫疗法在该细胞类型中的参与。

图3 T21是针对早期tau病理的免疫治疗保护所必需的。

（图源：Mukadam, Aamir S, et al., Science, 2023）

接下来，作者研究了T21在tau病理学转基因动物模型中的作用。在P301S-Tg小鼠中，早期tau病理可以通过腰椎切片中对磷酸化tau的免疫反应性来检测，从1个月开始，然后信号放大至7个月。Sarkosyl-不溶性tau和种子感受态物种在20至80日龄之间增加（图3A-C）。在非转基因C57BL/6小鼠中未检测到种子感受态物种（图3C），这表明种子活性起源于转基因tau。因此，作者评估了Abs是否可以通过被动Ab转移到P301S Tau-Tg T21^−/−和P301S Tau-Tg T21^−/−小鼠中来减少早期tau病理。用AP422，对照Ab 9C12（Con）或每周腹膜内仅注射PBS处理小鼠（图 3D）。免疫印迹显示，在T21^−/−动物中，AP422处理后不溶性tau水平降低>85%（图3E和F）。然而，在T21^−/−动物或使用对照Ab时未观察到Ab保护。作者进一步检查了这些制剂中种子能力tau物种的水平，并观察到AP422处理后T21依赖性显着降低（图3G）。对Sarkosyl不溶性tau积累的保护作用大于减少新的种子量级物种的产生。总之，Abs可以降低小鼠大脑中早期tau聚集的水平，且需要依赖T21参与。

图4 长期免疫治疗可增强T21依赖性对tau病变的保护。

（图源：Mukadam, Aamir S, et al., Science, 2023）

作者进一步试图确定T21参与成年小鼠的慢性Ab治疗方案。作者首先检查了生物素化Abs在循环中的持久性，并在P301S Tau-Tg与P301S Tau-Tg T21^−/−小鼠中观察到相似的半衰期（~7天）（图4A）。这表明T21不参与确定Ab持久性。因此，作者继续用PBS、C12（Con）或AP422治疗两种基因型17周，方法是每周向外周循环输注Abs（图4B）。AP422 对总 sarkosyl-不溶性tau（HT7）、AT8和抗pS422检测的过度磷酸化 sarkosyl-不溶性 tau 物种具有有效的保护作用，后者可检测AP422靶向的磷酸化表位（图 4C和D）。免疫荧光显微镜也观察到pS422阳性细胞体的减少。然而，在T21缺陷小鼠中，AP422无法预防tau病理。作者使用HEK293 P301S tau-venus细胞系量化脑匀浆和sarkosyl-不溶性组分中种子感受态物种的数量。与对照组9C12相比，AP422能够降低两种组分中的种子水平，但仅在表达T21时（图4E和F）。因此，在小鼠慢性免疫治疗期间需要T21来预防tau病理。

文章结论与讨论，启发与展望

在这项研究中，作者已经证明针对tau的免疫疗法主要依赖于细胞内Ab受体T21。缺乏T21表达的小鼠在tau发病的早期阶段和长期Ab治疗期间对被动免疫治疗无效。在T21^−/−−动物中，Abs无法降低大脑中不溶性tau蛋白的水平，并且未能减少种子感受态物种的产生。在离体切片培养实验中，作者观察到种子聚集物以主要依赖于T21的方式受到Ab中和的影响。在作者的模型中，由小胶质细胞上广泛表达细胞表面FcγR介导的其他效应机制效果不如T21。但作者发现tau-Ab复合物被神经元内化，并被细胞质中的T21识别。因此，作者的发现与Abs在tau-Ab复合物摄取到细胞之前与细胞外tau的结合是一致的。随后将T21与Abs结合以需要活性泛素化机制的方式中和播种活性。作者发现人类iPSC可表达可调节和功能性的T21，本文研究结果对临床免疫疗法治疗神经退行性疾病具有重要意义。最后，tau以外的具有类似朊病毒样行为的蛋白质，如α-突触核蛋白（a-synuclein）和TAR-DNA结合蛋白43（TDP-43），可能同样存在依赖T21介导的中和作用。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn1366

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编辑︱王思珍
本文完