Neuron︱北大李毓龙团队利用新型GRAB探针，解析组胺在睡眠-觉醒过程中的动态变化

（点击图片阅读；文末可预约视频号）

撰文︱董   辉

责编︱王思珍，方以一

组胺（Histamine，HA）是一种重要的单胺类信号分子，存在于中枢神经系统和外周组织，参与免疫、消化和神经信号调控。在外周，组胺参与过敏反应，因此抗组胺药物常被用来缓解过敏反应。然而，抗组胺药物的一大副作用是嗜睡，这引起了科学家对组胺在中枢系统中功能的关注。在大脑中，组胺能神经元的胞体主要分布于下丘脑结节乳头体核（Tuberomammillary nucleus，TMN），其神经纤维向全脑广泛投射；组胺能信号参与睡眠觉醒、学习记忆和摄食等过程。目前，人们对组胺的生理功能及作用机制方面仍有很多未知，其中一个重要的原因是缺乏灵敏、特异的工具，用于对组胺进行高时空分辨率地监测。

2023年3月15日，北京大学李毓龙实验室在Neuron杂志在线发表了题为“Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo”的研究论文，报道了新型基因编码的组胺探针GRAB_HA的开发，以及结合新工具对睡眠觉醒过程中的组胺动态调控的研究。（拓展阅读：李毓龙课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Neuron︱李毓龙团队发现五羟色胺调节关联学习记忆的时间窗口，揭开巴甫洛夫留下的百年之谜；Nat Biotechnol︱李毓龙实验室开发新型催产素荧光探针，揭秘神经肽的时空动态调控；Nat Rev Neurosci 综述︱李毓龙团队应邀撰写神经递质检测新技术的研究综述；Neuron︱李毓龙实验室开发新型荧光探针用于检测胞外ATP的时空动态变化）

在这项工作中，李毓龙实验室首先利用GRAB策略（GPCR-Activation Based Sensor）将循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP嫁接到四种人源组胺GPCR受体的第三个胞内环，发现基于H₄R的探针表现出优于其他受体的细胞膜定位特性。后续通过一系列优化，获得了基于H₄R的组胺荧光探针GRAB_HA1h（简称HA1h）。在HEK293T细胞中表达的HA1h探针对组胺有~370%的荧光信号响应（ΔF/F₀）和~17 nM的亲和力（EC₅₀）（图1）。为了进一步拓展探针对组胺的检测范围，作者选择了来自于不同物种的组胺受体，并开发了基于水熊虫H₁R的新型组胺荧光探针GRAB_HA1m（简称HA1m），HA1m探针对组胺的最大ΔF/F₀ ~590%，EC₅₀ ~380 nM。

图1：新型组胺探针的刻画。A, 组胺探针工作原理。B, 组胺探针HA1h、HA1m和HA1mut在HEK293T细胞上的表达及对组胺的反应。C, 组胺探针对饱和浓度组胺的响应曲线。D, 组胺探针HA1h和HA1m对不同浓度组胺的信号响应。

进一步作者在培养的HEK293T细胞中详细刻画了探针的动力学和是否解偶联下游信号（图2A-E）。通过快速喷药系统和快速成像系统检测了探针的动力学特性。HA1h和HA1m探针能在亚秒级（~0.3-0.6 s）时间尺度上响应胞外组胺浓度变化。探针基于GPCR构建，是否会偶联下游信号影响细胞的正常生理功能呢？GPCR主要偶联下游G蛋白和β-arrestin信号通路。野生型组胺受体H₄R和H₁R可以很好地偶联下游且G蛋白和β-arrestin信号通路，而组胺探针HA1h和HA1m均不偶联GPCR下游胞内信号。作者进一步在培养的原代神经元中刻画了探针的上膜特性、信号响应大小，并验证探针的特异性和药理学特性（图2F-J），发现HA1h和HA1m探针具有良好的膜定位，能够特异地响应组胺，而且对组胺的前体、组胺代谢产物和其它神经递质均不响应，并且组胺引发的信号能够被相应受体的拮抗剂阻断，这说明探针保留了相应骨架受体的药理学特性。

图2：组胺探针在培养细胞中的刻画。A-C, 探针动力学刻画。D,E, 探针不偶联下游信号。F-I,探针在培养神经元中上膜，响应大小和亲和力。J,探针特异性和药理学特性。

组胺探针是否能够用于检测内源组胺的释放？首先，作者借助AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的前额叶皮层（Prefrontal cortex, PFC），制备急性脑切片并使用双光子成像，实验成功地记录到了电刺激引起的组胺秒级释放（图3）。此外，作者还实时地观察到组胺信号从刺激位置向外的扩散。因此，组胺探针HA1m可以实现高时空分辨率地检测内源组胺的释放。

图3：组胺探针HA1m用于检测急性脑片中组胺的释放。A,B,探针在脑片中的表达。C-E,电刺激诱导组胺释放。F-H，探针可以检测到组胺释放和扩散。I,J，探针对饱和浓度的组胺的响应。

组胺探针是否能够应用于活体动物中？众所周知，组胺是调控睡眠觉醒的重要分子，视前区（Preoptic area, POA）是参与睡眠觉醒调控重要的脑区之一，且接收组胺能神经元的密集投射。作者首先利用AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的视前区，通过光纤记录探针的荧光信号，同时记录小鼠脑电和肌电以判断睡眠状态（图4）。组胺探针HA1m可以实现在完整睡眠觉醒周期中，长时间且稳定地报告组胺动态变化。与前人微透析结果一致的是，探针信号在觉醒期最高，非快速眼动（NREM）睡眠期次之，快速眼动（REM）睡眠期最低。作者进一步分析了不同睡眠时相转换过程组胺的动态变化，发现在小鼠快速眼动睡眠向觉醒转换和非快速眼动睡眠向觉醒转换过程中组胺信号升高，在觉醒向NREM睡眠转换和NREM睡眠向REM睡眠转换过程中组胺信号下降。作为对照，作者在组胺合成酶敲除（HDC KO）的小鼠中发现HA1m探针信号没有明显变化。综上所述，HA1m探针能够在活体小鼠中对组胺动态变化进行可靠、特异、实时地检测。

图4：组胺探针HA1m用于在体检测组胺动态变化。A, 组胺探针用于记录小鼠视前区组胺在睡眠觉醒过程中的动态变化的模式图。B,C, 组胺探针在野生型小鼠中信号。D,E,组胺探针在组胺合成酶敲除小鼠中的信号。F, 组胺探针在不同睡眠时相转换过程中的动态变化。

组胺神经元胞体位于下丘脑结节乳头体核，并向全脑发出广泛投射。那么，组胺在不同脑区中的动态变化模式是否一致？作者将HA1h探针表达在小鼠的视前区（POA）和前额叶皮层（PFC），同时记录了这两个脑区的组胺在睡眠觉醒中的动态变化（图5）。结果发现，两个脑区组胺探针信号大小在相同的睡眠时相中是一致的。有趣的是，在REM睡眠向觉醒转换、NREM睡眠向觉醒转换和觉醒向NREM睡眠转换过程中，视前区的组胺变化动力学比前额叶皮层更快，这提示了组胺在不同脑区中可能存在不同的调控模式。综上，利用新型高时空分辨率高亲和力的组胺探针，作者发现不同脑区的组胺动力学存在差异，为研究组胺的功能提供了重要的启示。

图5：不同核团组胺动态变化动力学在睡眠时相转换过程中存在差异。A, 探针表达和记录示意图。B, HA1h探针在PFC和POA的动态变化曲线。

文章结论与讨论，启发与展望

本项工作基于GRAB原理开发了一对新型组胺荧光探针，可用于灵敏、特异、实时地检测胞外组胺的动态变化。作者利用“新工具”探针，观察到了“新发现”，不同核团的组胺释放存在不同的动力学特征，为下一步产生“新观点”提供了重要启示。在本项工作中，作者只开发了绿色的组胺荧光探针，并没有实现多种神经递质同时检测。下一步，可以开发更多颜色的神经递质荧光探针，实现多种神经递质的同步检测。

在中枢神经系统中，除了本项工作研究的睡眠觉醒调控外，组胺也参与其它多种重要的生理/病理过程，包括摄食、运动、认知、癫痫和偏头痛等。在外周系统中，组胺还参与过敏反应、瘙痒和胃酸分泌等过程。新型的组胺荧光探针将会成为研究组胺具体参与的生物学功能和其调控机制的有力工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.02.024

北京大学生命科学学院博士后董辉和博士生李梦尧（已毕业）为本文共同第一作者，李毓龙教授为通讯作者，实验室成员鄢羽岐、钱统瑞、林云致、刘灿、李国川和王欢对文章做出了重要贡献。该工作得到了阿姆斯特丹自由大学（Vrije Universiteit Amsterdam） Rob Leurs教授及其团队Xiaoyuan Ma和Henry F. Vischer的通力合作，以及浙江中医药大学/浙江大学陈忠教授团队和复旦大学中山医院杨向东教授团队的大力支持。该工作得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、生命医学峰基金和宋晨枫与高欣欣公益基金会等机构、经费和项目的大力支持。

通讯作者李毓龙（第一排左三），共同第一作者董辉（第三排右二），共同第一作者李梦尧（第一排左二）。

（照片提供自李毓龙团队）

更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/。此外，李毓龙实验室诚聘不同学科背景的副研究员、博士后及技术员，待遇从优。欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入！

转载须知：“逻辑神经科学”特邀稿件，本内容著作权归作者和“逻辑神经科学”共同所有，欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。

辑神经科学群：文献学习2

扫码添加微信，并备注：逻辑-文献-姓名-单位-研究领域-学位/职称      

往期文章精选【1】PNAS︱首次！浙大/浙中医大陈忠团队建立全脑3D组胺能神经投射图谱
【2】外源性单核细胞样骨髓源性抑制细胞改善5xFAD小鼠因感染牙龈卟啉单胞菌所致的免疫失衡、神经炎症和认知障碍【3】STAR Protocols｜深圳先进院杨慧团队在开发人眼角膜屏障芯片用于评估角膜损伤修复取得最新成果【4】Transl Psychiatry丨北理工庆宏/全贞贞团队揭示NB-ACx-BLA神经环路调控听觉恐惧记忆的区分【5】南医大赵洁/蔡铮团队揭示葛根抗性淀粉驱动肠道菌群产生褪黑素改善缺血性脑卒中的机制【6】ARR 综述︱北理工唐晓英课题组聚焦基于弥散张量成像的阿尔兹海默病白质异常变化【7】Neuron︱神经退行性疾病治疗潜在新靶点！GSDME蛋白介导轴突线粒体损伤和神经退行性变【8】40年随访揭示不良口腔健康增加人群患痴呆的风险【9】专家点评 Nat Neurosci︱突破！南京大学闫超团队揭示脂质堆积的反应性星形胶质细胞促进癫痫疾病进展【10】Adv Sci︱李韶课题组揭示AQP4通过抑制Nav1.6介导的星形胶质细胞自噬加重脓毒症相关脑病认知障碍科研学习课程精选【1】多模态脑影像数据的处理与分析及论文写作培训班（4月15-16日，腾讯会议）【2】Python生物信息从入门到进阶研讨会（4月7-9日，腾讯会议）【3】计算机辅助药物设计技能实操研讨会（4月15-16日，腾讯会议）【4】肠道菌群与代谢组学研究策略研讨会（延期至2023年4月22-23日，腾讯会议）【7】R语言生信数据分析及可视化作图（网络）研讨会（延期至3月31-4月2日，腾讯在线会议）【8】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会（4月15-16日，腾讯在线会议）【9】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（4月8-9日 腾讯会议）学术会议预告【1】会议通知︱中国神经科学学会神经胶质细胞分会2023学术年会暨“神经胶质细胞代谢调控与疾病”专题国际研讨会
【2】会议通知︱2023年成瘾与脑科学国际研讨会暨中国药物滥用防治协会成瘾与脑科学分会第一届学术会议（2023年4月9-10日，深圳）【3】会议通知︱2023中国衰老科学大会第一轮通知（2023年4月21-23日，北京）【4】会议通知︱中国神经科学学会神经影像学分会2023学术年会（2023年5月19-21日，广州）【5】学术会议预告︱Novel Insights into Glia Function & Dysfunction（2023年4月24-28日，日本）【6】会议通知︱第六届中国神经科学学会神经退行性疾病分会年会会议通知（2023年4月7-9日，湖南长沙）【7】会议通知更新︱小胶质细胞生理与病理功能专题国际研讨会（2023年3月30-4月1日，深圳）          
编辑︱王思珍
本文完