在自然界中，动物应对危险环境时，需要将不同感官刺激（图像，气味，声音等）与危险信号关联起来并进行区分，以便于快速作出反应和更好的适应自然。如果个体无法将感官刺激与危险信号关联所形成的记忆进行区分，或者是区分出现混淆，会导致对危险信号的过度泛化，这也是导致创伤后应激障碍的主要原因之一。听觉是主要的感官刺激之一，与听觉恐惧区分相关的神经回路尚未清楚。现有研究表明，基底核（Basal Nuclei，NB）的胆碱能神经元是接收感觉信息与调节恐惧记忆的主要系统。杏仁核对恐惧记忆至关重要，基底外侧杏仁核（Basolateral Amygdala，BLA）的椎体神经元和中间神经元接受来自基底核（NB）胆碱能神经元的输入。光遗传刺激来自NB的胆碱能神经元可通过诱导BLA锥体神经元放电，抑制或激活神经元活动，进而诱导皮层到BLA的投射的长时程增强，在恐惧记忆的消退中发挥作用。胆碱能信号能够调节皮层到杏仁核的可塑性影响条件恐惧行为。然而，NB中的胆碱能信号是否会影响ACx-BLA环路对区别听觉恐惧记忆（DAFM）的调节仍不清楚。
2023年03月，北京理工大学生命学院分子医学与生物诊疗工信部重点实验室庆宏和全贞贞课题组在Translational Psychiatry杂志上发表了题为“ACx-projecting cholinergic neurons in the NB influence the BLA ensembles to modulate the discrimination of auditory fear memory”的研究论文。这项工作阐明了NB ACh-ACx-BLA投射对DAFM的关键调控机制。首先，为了明确小鼠能够区分听觉关联记忆，课题组设计了基于听觉刺激的恐惧记忆区分行为学范式。在编码阶段对小鼠进行足部电击（恐惧信号），并伴有10kHz的声音，在检索阶段，依次给予小鼠非恐惧信号耦合的1kHz声音和与恐惧信号耦合的10kHz声音（图1B）。统计小鼠的恐惧反应，发现在检索阶段，小鼠听到非恐惧信号耦合的1kHz声音时，有较低的恐惧反应, 而在听到恐惧信号耦合的10kHz声音时，恐惧反应明显增加（图1C）。这表明小鼠能够区分1kHz、10kHz关联的听觉恐惧记忆。听觉皮层（ACx）是感觉加工的主要部位，在DAFM中起着重要作用。为了确定ACx中的胆碱能信号是否参与DAFM，课题组在ACx中注射AAV9-Syn-ACh3.0病毒，记录ACx中的乙酰胆碱（ACh）信号(图1A)。结果显示，小鼠在编码阶段接受足部电击并伴有10kHz声音时，ACh逐渐增加（图1D左）。在检索阶段，在1kHz声音下的ACh信号明显低于10kHz的ACh信号，这说明ACh信号参与了听觉恐惧记忆区分。随后课题组在ACx中注射乙酰胆碱受体抑制剂来抑制ACh信号，发现N型受体拮抗剂美加明（MCM）能显著降低小鼠的区分指数（图1G），而M型受体拮抗剂阿托品(AP)的处理不影响小鼠的区分能力（图1H）。说明听觉皮层的胆碱能信号通过nAChR参与调控听觉恐惧记忆区分。图1 ACx中的ACh信号通过nAChR参与DAFM课题组在chat-cre小鼠的NB分别注射了抑制（NpHR3.0）或兴奋（chrimsonR）病毒，激活或抑制投射到ACx的NB胆碱能神经末梢，同时在ACx植入ACh3.0探针并记录乙酰胆碱信号(图2A和B)。结果发现，在编码阶段抑制NB-ACx的投射，会导致抑制组小鼠在1kHz检索阶段的恐惧时间和Ach信号增加（图2C和D），在10kHz检索阶段的恐惧时间减少，Ach信号变化不大，区分指数显著降低(图2C)。当激活NB到ACx的投射时，光激活组小鼠的区分指数与对照组没有明显差异，ACh信号水平也没发生变化（图2E和F）。而在光抑制的基础上加入n型ACh受体的激动剂尼古丁可以恢复由于抑制NB-ACx投射引起的区分能力的下降。进一步表明，在编码阶段，ACx在NB中投射的胆碱能信号是DAFM所必需的。图2 ACx中ACh信号在编码阶段的光遗传调控了DAFM接下来，课题组应用cfos-rtTA系统来标记对于不同音调响应的ACx神经元，同时以光遗传方式操纵它们的神经活动（图3A和B）。发现当抑制10kHz响应的ACx神经元时，抑制组小鼠在10kHz检索阶段的恐惧时间显著缩短，与对照组相比变化指数降低(图3D, 右1,2)。而在1kHz检索阶段，变化指数不受影响(图3D, 左1，2)。当抑制1kHz响应的ACx神经元时，小鼠在1kHz和10kHz检索阶段的恐惧时间和变化指数均不受影响（图3F）。而激活ACx中的10kHz响应神经元时，激活组小鼠在10kHz检索阶段的恐惧时间不变，在1kHz检索阶段的恐惧时间则显著增加(图3H)。证实了ACx有对不同音调响应的神经元集群在听觉恐惧记忆区分中发挥作用。为探究不同音调响应群神经元是否能够调节BLA神经元并参与到听觉恐惧记忆的区分中，课题组在编码和检索阶段分别用c-fos-tTA系统和RAM-cre-ERT系统标记激活的BLA神经元(BLA神经元)和不同音调响应的ACx神经元簇。抑制ACx中的10kHz响应神经元时，BLA神经元的神经活动在10kHz检索阶段明显下降，但在1kHz检索阶段不受影响(图3M)。而激活10kHz响应神经元时，BLA神经元的活动性在1kHz和10kHz检索阶段都显著增加(图3O)。这些结果说明ACx不同音调响应的神经元会通过调节BLA神经元活动性进而影响听觉恐惧记忆的区分。图3 ACx中音调响应神经元的光遗传调节BLA神经元以调节DAFM随后，课题组在chat-cre的老鼠的NB注射了DIO-NpHR3.0病毒抑制胆碱能神经元，并用c-fos-tTA系统标记ACx不同音调响应的神经元群(图4A)。结果发现，当抑制NB-ACx的投射时，编码阶段标记的10kHz音调响应的神经元与检索阶段1kHz音调响应神经元的共定位增加(图4C和E)，但与检索阶段10kHz音调响应的神经元的共定位减少(图4D和F)。这说明在编码阶段抑制NB-ACx胆碱能信号会影响音调响应的ACx神经元的激活，导致ACx神经元簇在对不同音调的响应中出现混淆。 图4 在编码阶段，胆碱能信号通路影响ACx神经活动以调节音调响应神经元为了进一步确定抑制NB- ACx投射是否会影响BLA神经元的神经活动，课题组又在chat-cre的老鼠的NB注射病毒来抑制胆碱能神经元，在BLA 注射了c-fos-rtTA和TRE-Gcamp6s以记录BLA神经元的神经活动（图5A）。结果显示，在正常情况下，在10 kHz音调检索下，BLA神经元比在1 kHz音调检索下表现出更高的活动性(图5C和D)。抑制NB-ACx胆碱能投射时，BLA神经元的神经元活动性在10 kHz音调检索下降低，在1 kHz音调检索下升高(图5E-H)。此外，再激活的BLA神经元(EGFP+c-fos+/EGFP+)在1 kHz音调检索下增加，但在10 kHz音调检索下减少(图5I-L)。这一数据表明，在编码阶段抑制NB-ACx的胆碱能投射会降低BLA神经元的活动性和再激活，从而导致听觉恐惧记忆区分能力的降低。图5 在编码阶段刺激ACx的胆碱能输入影响BLA神经元的再激活
综上所述，该研究揭示了NBACh-ACx-BLA神经环路在DAFM的调节中起着关键作用：NB-ACx的胆碱能信号投射通过N型乙酰胆碱受体调节ACx对不同声音响应的神经元群的活动性，进而影响BLA神经元的再激活而调控听觉恐惧记忆的区分。实验还发现nAChR激动剂尼古丁可以恢复因抑制NBACh-ACx投射而下降的区分能力。因此，在特定的轴突末端对尼古丁胆碱能信号的操纵可能为治疗与某些神经生物学疾病相关的区分性恐惧记忆缺陷提供新的治疗方法。
有研究发现ACx中星形胶质细胞的α7-nAChR可被厌恶感觉刺激激活，这是恐惧记忆持续所必需的。因此，ACh信号通路是否会影响ACx音调反应神经元的突触可塑性，以及这种影响是通过神经元上的胆碱能受体实现的，还是通过星形胶质细胞参与DAFM的，还有待进一步研究。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41398-023-02384-8
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编辑︱王思珍
本文完