STAR Protocols︱浙大张洪海团队发表调节血清素能神经环路以预防癫痫猝死的实验方案

撰文︱王预龄审阅︱张洪海责编︱王思珍，方以一

全球有近7000万的癫痫患者，而癫痫猝死（Sudden unexpected death in epilepsy，SUDEP）是最严重的并发症，是造成癫痫患者死亡的最主要的原因，临床上风险仅次于中风。仅在中国每年死于SUDEP的患者就超过2万例。由于其发病机制复杂，目前医学界对于SUDEP发生机制的认识依然有限，尤其中国对于SUDEP的研究仍处于起步阶段。癫痫发作诱发的呼吸骤停（Seizure-induced respiratory arrest，S-IRA）是SUDEP发生的一个主要因素。有研究显示某些特定的神经核团参与其发生，然而，鲜少着眼于脑内的神经环路。因此，使用特定的技术，深入解析脑内参与调控S-IRA及SUDEP的神经环路对临床预防和治疗SUDEP具有重要意义。

2023年2月24日，浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院张洪海教授团队在Cell子刊STAR Protocols杂志在线发表了题为“Protocol for modulation of the serotonergic DR-PBC neural circuit to prevent SUDEP in the acoustic and PTZ-induced DBA/1 mouse models of SUDEP”的实验方案文章（Protocol），详细阐释了如何通过调控中缝背核-前包钦格复合5-羟色胺能神经环路来预防癫痫猝死的方法。上述实验方法在该课题组2022年iScience杂志上发表题为“Dorsal raphe nucleus to pre-Bötzinger complex serotonergic neural circuit is involved in seizure-induced respiratory arrest”研究性论文中运用。

该方案首先介绍了声音刺激及戊四唑诱导的DBA/1小鼠模型的制备方法，以及癫痫发作的诱发和抢救。接着详细介绍了立体定向手术，病毒注射和脑内设备的植入的步骤。为了避免第二次手术造成的损害和脑内核团定位困难，作者在一次手术中同时完成了病毒注射和设备植入。该方案主要是基于立体定向注射，将药物或病毒输送到目标脑区。

病毒注射过程中，建议注射速度设置为10-40 nl/min，注射时间控制在10 min内。在显微注射过程中，通过显微镜观察玻璃电极中的病毒和液体石蜡的液面分层是否下降。为避免病毒渗漏到目标脑区上方的核团，注射后的停针时间不应少于10 min，一方面可以让病毒扩散，另一方面可以防止病毒随着针头的拔出而漏出目标脑区。

图1 立体定向手术仪器及植入脑内的设备

（图源：Wang YL, et al., STAR Protoc, 2023）

图2 小鼠的立体定向手术（病毒注射，光纤植入，套管植入）

（图源：Wang YL, et al., STAR Protoc, 2023）

最后作者详细阐述了光遗传实验以及光纤记录钙信号的实验方法。光刺激的参数为蓝光（465 nm，20 Hz，20 ms脉宽，15 mW，20分钟）由激光器通过200 μm的光纤传递。在光纤记录实验中，需要同时记录410 nm信号来去除背景噪声信号，获得真实的钙信号数据。并且，由于钙信号的记录容易受到外界光线的影响，为保证钙信号记录的准确性，建议在光线稳定、暗光的实验室进行光纤光度实验。

图3 整体实验方案流程图

（图源：Wang YL, et al., STAR Protoc, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究方案通过构建两种动物模型，利用药理学、光遗传学、光纤记录、逆向示踪和脑电分析的技术，层层深入解析脑内参与调控SUDEP的神经环路，为临床预防和治疗SUDEP提供有效靶点和干预措施。同时该实验方案详细介绍了立体定向手术，设备植入，病毒注射以及脑室内给药技术的手术和注射方法。该实验方案还提供了实验过程中可能出现的问题的解决方案，可以作为研究SUDEP机制的重要参考。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102129

浙江中医药大学硕士王预龄，浙江大学硕士许晴，浙江中医药大学硕士于倩及顾乐园为这一工作共同第一作者，张洪海教授为通讯作者。该研究工作得到了国家自然科学基金及浙江省自然科学基金重点项目的资助。

通讯作者：张洪海

（照片提供自：张洪海团队）

通讯作者简介：张洪海，教授，主任医师，浙江大学博士研究生导师，上海交通大学医学博士，美国哈佛大学博士后，杭州市卫计委重点学科后备学科带头人，杭州市新世纪131优秀中青年人才计划（第一层次）培养人选，浙江省重点专科神经外科及儿科核心成员（申报中），入选中华医学会麻醉学分会第四期未来领军人才培训。先后主持国家自然科学基金面上项目2项，浙江省自然科学基金2项（重点项目1项），长期致力于SUDEP发生机制的研究，以第一或者共同第一及通讯作者身份先后在Epilepsia, Neurobiology of Disease, Epilepsy & Behavior、Biomedicine & Pharmacotherapy、iScience、STAR protocols等权威期刊上发表系列论著，相关研究成果四次入选美国癫痫学会（AES：American Epilepsy Society）年会，其工作受国际顶级期刊Nature Reviews Neurology（IF=44.711）长篇评述和肯定评价，目前该团队SUDEP研究成果在国内该领域处于领先地位。

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编辑︱王思珍
本文完