美国USF叶立斌团队使用19F定量核磁共振分离聚集中间态并揭示了微开关控制GPCR构象变构过程

来源︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”

撰文︱王旭东

审阅︱叶立斌

责编︱王思珍，方以一

G 蛋白偶联受体（GPCR）是人体中最大的膜蛋白家族，包括800多个成员。GPCR结构包括七个跨膜α螺旋（TM1-TM7）结构域以及多个胞外和胞内环形结构。GPCR在许多重要的生理过程中发挥着关键作用，包括视觉、味觉、嗅觉、神经递质信号转导、内分泌调节和免疫反应等。目前，市场上FDA批准的药物中三分之一作用在GPCR上；然而，只有大约100种GPCR被用用临床药物开发的靶点。

通过X射线晶体衍射和冷冻电子显微镜等技术，近年来多个GPCR的高分辨率结构被解析，这极大地推动了我们对GPCR所参与信号转导的科学认识。这些结构为深入理解GPCR的功能和药物设计提供了重要的基础[1-2]。然而，它们所呈现的均为静态结构，构象之间的转换以至动态变化信息非常有限。目前已解析的GPCR结构多局限于低能的全息非活性或者终端激活两个终点构象[3]，对于中间态构象结构和功能研究甚少。GPCR的构象转换和动力学研究正在成为继静态结构生物学后的研究热点，理解中间态构象在信号转导中的作用对于揭示GPCR的激活过程和调控相关信号至关重要。

2023年3月10日，美国南佛罗里达大学叶立斌团队联合加州理工学院William A. Goddard院士和洛斯阿拉莫斯国家实验室Chris Neale博士在Nature Communications发表题为"Intermediate-state-trapped mutants pinpoint G protein-coupled receptor conformational allostery" 的文章（王旭东博士研究生和Chris Neale博士为共同一作），报道了在¹⁹F定量核磁共振指导下分离和聚集中间态构象的可行性。该研究同时报道了一个保守的位于GPCR的TM7/H8的R291^7.56/ R293^8.48和TM6上的H230^6.32之间的“cation-π”微调切换开关，作为“门卫”来调节G蛋白插入胞内G蛋白结合腔。不同于先前确定的TM3和TM6之间的离子锁主要调节GPCR两个非活性状态之间的构象转换[4]，该“cation-π”开关主要调节活性构象和非活性构象之间的转换。

首先，研究人员以腺苷A_2A受体（A_2AR）作为模型进行全分子动力学模拟（MD），生成了A_2AR-Gα_sβγ与部分激动剂（LUF5834）或全激动剂 （NECA）结合的复合物结构（图1）。NECA-A_2AR-Gα_sβγ模型显示A_2AR的胞内环3（ICL3）和Gα_s的α-helix domain（AHD）之间有两个分子间盐桥。研究人员发现这些盐桥不存在于预测的LUF5834-A_2AR-Gα_sβγ复合物中。 这种蛋白相互作用的特异性启发研究人员设计出能够猝灭全效激动信号以及相对应的全激动构象，并能稳定于中间态构象的A_2AR突变体。

图1. 基于模拟的部分激动剂和全激动剂的A_2AR-Gα_sβγ复合物结构

（图源：X, Wang et al., Nature Communications, 2023)

为了观测这些A_2AR突变体构象的变化，研究人员利用氟（¹⁹ F）对微环境变化敏感的特性建立了一个¹⁹F的核磁共振系统来探测A_2AR结构的变化[5]。研究人员在A_2AR的V229C处固定¹⁹F探针来探测A_2AR受体从非活性态构象（S1）到完全激活态构象（S5）之间的变化（图2）。

图2. 通过在V229C上进行¹⁹F标记探测不同构象偏向突变体的NMR

（图源：X, Wang et al., Nature Communications, 2023)

在受体激活过程中，TM6会从疏水区旋转到亲水区逐步暴露V229C残基至水环境中，因此这些19F-NMR谱图根据不同的溶剂暴露程度勾勒出构象状态，其中五个构象状态S1到S5的进展顺序从低磁场（水暴露度较小）到高磁场（水暴露度更大）。基于核磁共振数据，研究人员揭示了A_2AR的R291^7.56和R293^8.48在受体激活过程中的作用通过调节G蛋白结合腔的来调节受体异构变化。

图3. TM3 和TM6 之间的离子锁以及TM7/H8 和TM6之间的cation-π 微开关在A_2AR激活中的变构作用

（图源：X, Wang et al., Nature Communications, 2023)

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究揭示了所有不同构象状态之间的动态转变过程（图3）。在S1状态下，GPCR的离子锁DR ^3.50 Y-E ^6.30和cation-π 的相互作用（R291^7.56-H230^6.32和 R293^8.48-H230^6.32）形成，TM3、TM6 和TM7/H 紧密堆积在一起。随着激活的进行，S1构象转变为S2构象，此时离子锁（DR ^3.50 Y-E ^6.30）被打破。S3构象将形成受体和Gαβγ之间的预激活耦合复合体。受体被部分激活后，GPCR进行构象重排以形成S4构象，促进Cα5伸入结合腔，直到在GPCR和Gαβγ之间形成完全开放的构象复合物，核苷酸自由交换。GTP结合将导致Gαβγ解离为Gα和Gβγ。随着对S1-S5不同构象功能更深入的了解，这一研究可以指导设计靶向S3、S4和S5构象的药物。此外，中间态构象的捕获或稳定对于设计高效中间催化态的催化酶也具有指导意义。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36971-6

通讯作者简介:叶立斌教授任职于南佛罗里达大学分子生物科学系和Moffitt癌症研究中心，实验室致力于GPCR的动力学和信号转导研究, 课题组目前与多所顶级高校具有实质性合作并取得相关研究的突破性进展。申请人如对课题组感兴趣，请发邮件至：[e-mail]；申请人应具有核磁共振、蛋白纯化、分子生物学或细胞培养等方面的经验。

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 参考文献（上下滑动查看）  

1 Palczewski, K. et al. Crystal structure of rhodopsin: AG protein-coupled receptor. science 289, 739-745 (2000).

2 Liang, Y.-L. et al. Phase-plate cryo-EM structure of a class B GPCR–G-protein complex. Nature 546, 118-123 (2017).3 Bai, C. et al. Exploring the activation process of the β2AR-Gs complex. Journal of the American Chemical Society 143, 11044-11051 (2021).4 Li, J., Edwards, P. C., Burghammer, M., Villa, C. & Schertler, G. F. Structure of bovine rhodopsin in a trigonal crystal form. J Mol Biol 343, 1409-1438, doi:10.1016/j.jmb.2004.08.090 (2004).5 Ye, L., Van Eps, N., Zimmer, M., Ernst, O. P. & Prosser, R. S. Activation of the A2A adenosine G-protein-coupled receptor by conformational selection. Nature 533, 265-268, doi:10.1038/nature17668 (2016).

编辑︱王思珍
本文完