Sci Adv+Theranostics︱袁增强/程金波揭示钙稳态调节蛋白Calhm2调控神经退行性疾病新机制

撰文︱程金波

责编︱王思珍，方以一

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）和帕金森氏病（Parkinson’s Disease，PD）是最主要的两种神经退行性疾病，其发病机制尚未阐明，临床更缺少有效的治疗手段。神经炎症是这两种退行性疾病的重要特征，也是疾病发生发展的重要原因。钙稳态失衡与神经炎症产生、神经退行性疾病的发生发展密切相关[1, 2]，然而，钙稳态失衡与神经炎症发生的分子机制并不清楚。

2021年8月，军事医学研究院的袁增强教授、中央民族大学的程金波教授联合团队在Science Advances （中科院1区Top期刊，IF=14.9）在线发表了题为“Microglial Calhm2 regulates neuroinflammation and contributes to Alzheimer’s disease pathology”的研究论文，揭示了Calhm2在小胶质细胞激活中的重要作用，并为靶向小胶质细胞介导的包括AD在内的神经炎症相关疾病提供了潜在治疗靶点。（详见“逻辑神经科学”报道：Sci Adv︱重要发现！钙稳态调节蛋白Calhm2调控小胶质细胞激活以及参与阿尔茨海默病进程）

近日，军事医学研究院的袁增强教授、中央民族大学的程金波教授再次在国际医学著名期刊Theranostics（中科院1区Top期刊，IF=11.6）上发表题为“Deletion of Calhm2 alleviates MPTP-induced Parkinson’s disease pathology by inhibiting EFHD2-STAT3 signaling in microglia”的研究成果。（拓展阅读：袁增强/程金波团队相关研究进展，详“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Neurosci Bull︱突触相关蛋白Dlg1通过抑制小胶质细胞激活改善小鼠抑郁样行为；Sci Adv︱重要发现！钙稳态调节蛋白Calhm2调控小胶质细胞激活以及参与阿尔茨海默病进程）

本项研究工作是Calhm2 调控AD研究工作（Science Advances，2021）（详见“逻辑神经科学”报道：Sci Adv︱重要发现！钙稳态调节蛋白Calhm2调控小胶质细胞激活以及参与阿尔茨海默病进程）的进一步延续，首次明确Calhm2介导的神经炎症参与PD的疾病进程，抑制Calhm2介导的神经炎症可以有效改善PD模型小鼠的病理损伤和运动障碍。机制研究方面，通过构建Calhm2-HA转基因小鼠以及结合质谱分析方法，发现Calhm2可以与EFhd2相互作用，并介导下游STAT3信号通路的活化，从而调控小胶质细胞的炎症反应。以上两项工作揭示了Calhm2参与小胶质细胞激活的分子机制，为药物干预AD和PD提供了重要的分子靶点，为临床疾病的防治提供了新策略（图1）。

图1：Calhm2调控小胶质细胞激活参与PD进程的分子机制示意图

近年来，钙稳态调节蛋白在神经退行性疾病中的作用受到越来越多的关注。该家族共包括3个成员，分别是Calhm1、Calhm2以及Calhm3，其中Calhm1突变体P86L与AD的发生密切相关[3]。团队前期研究发现Calhm1蛋白并不在小鼠脑内表达，敲除小鼠也未表现出明显的认知损伤[4]，后续研究显示Calhm1主要表达在II型味蕾细胞并调控ATP的释放和味觉[5]。Calhm2广泛表达在小鼠脑内，目前Calhm2的蛋白结构已被解析[6, 7]。在功能方面，小胶质细胞Calhm2条件性敲除可以抑制AD模型小鼠的病理损伤，改善AD模型小鼠的认知障碍，提示Calhm2参与小胶质细胞激活和AD的发生发展[8]。然而，Calhm2是否参与PD的发生发展，以及调控的分子机制都不清楚。

在本项研究中，首先，研究人员利用Calhm2 WT和Calhm2 KO小鼠，结合PD的制备模型，发现Calhm2敲除可以很好保护由MPTP注射引起的神经损伤和小鼠运动障碍。通过免疫荧光染色和统计分析，发现Calhm2 KO可以有效抑制MPTP注射引起的小胶质细胞数目的增加，然而对星形胶质细胞的数目没有明显影响（图2）。

图2. Calhm2敲除改善PD模型小鼠的病理损伤和运动障碍

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

为了进一步确定Calhm2发挥作用的细胞类型，研究人员利用小胶质细胞条件性Calhm2基因敲除小鼠（Calhm2^{flox/flox:Cx3cr1-CreER}），结合PD动物制备模型，发现小胶质细胞中Calhm2缺失显著改善PD模型小鼠的病理损伤和运动障碍，提示Calhm2在小胶质细胞激活中发挥重要作用（图3）。

图3. 小胶质细胞Calhm2条件性敲除改善PD模型小鼠的病理损伤和运动障碍

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

接下来，研究人员利用神经元Calhm2基因条件性敲除小鼠（Calhm2^{flox/flox:CamKIIa-iCre}），结合PD动物制备模型，发现神经元中Calhm2缺失并不改变MPTP注射引起的神经损伤和胶质细胞活化，提示神经元中的Calhm2在PD模型中神经损伤和胶质细胞活化中的作用不大（图4）。

图4. 神经元Calhm2条件性敲除并不影响PD模型小鼠的病理损伤

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

为了进一步阐明Calhm2基因在小胶质细胞激活中的作用机制，研究人员构建了小胶质细胞过表达Calhm2的稳定细胞株，并进行了免疫沉淀实验和质谱分析，分析发现Calhm2可以与EFhd2相互作用。同时研究人员构建了Calhm2-HA标记小鼠，并对脑组织进行了免疫沉淀实验并进一步进行了质谱分析。研究发现Calhm2与EFhd2同样在小鼠的脑组织中存在相互作用。另外研究人员在HEK293T细胞系中对Calhm2和EFhd2的相互作用进行了验证（图5）。

图5. Calhm2与EFhd2存在相互作用

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

为了进一步研究Calhm2对EFhd2的调控，研究人员首先检测了Calhm2对EFhd2转录水平和蛋白水平的影响，结果显示Calhm2过表达以及敲除都不影响EFhd2的水平，提示Calhm2并不作用于EFhd2的转录水平和蛋白水平。研究表明，EFhd2的酪氨酸磷酸化参与体外巨噬细胞的活化 [9]，然而在小胶质细胞中的作用并不清楚。因此研究人员对Calhm2是否影响EFhd2的磷酸化进行了检测，结果表明Calhm2敲低降低了EFhd2的酪氨酸磷酸化水平。另外，文献表明EFhd2可以介导下游STAT3的磷酸化 [10]，因此，研究人员检测了小胶质细胞中Calhm2和EFhd2对STAT3磷酸化的作用。结果显示Calhm2敲低、EFhd2敲低都可以显著降低小胶质细胞内的p-STAT3的水平，以上结果提示Calhm2可以影响小胶质细胞内EFhd2-STAT3信号通路（图6）。

图6. Calhm2作用小胶质细胞中EFhd2-STAT3信号通路

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

进一步研究人员检测了EFhd2在小胶质细胞激活中的作用，利用体外LPS介导的炎症细胞模型，结果显示敲低EFhd2显著降低LPS刺激引起的炎症水平，这一结果与Calhm2敲低结果相一致，进一步提示Calhm2作用于EFhd2进而介导小胶质细胞的炎症反应（图7）。

图7. EFhd2敲低显著降低LPS介导的炎症水平

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

图8. Calhm2调控小胶质细胞活化以及参与PD的模式图

（图源：Bo et al., Theranostics, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

这项研究通过PD动物模型，结合Calhm2全身敲除小鼠和条件性敲除小鼠，明确了Calhm2在小胶质细胞激活中的重要作用和分子机制，为靶向小胶质细胞激活以及神经炎症提供了重要靶点（图8）。

本项研究工作是Calhm2调控AD进程研究工作（Science Advances，2021）（详见“逻辑神经科学”报道：Sci Adv︱重要发现！钙稳态调节蛋白Calhm2调控小胶质细胞激活以及参与阿尔茨海默病进程）的进一步延续。两项研究工作明确了Calhm2介导的神经炎症参与AD和PD的疾病进程，揭示了Calhm2参与小胶质细胞激活的分子机制，为药物干预AD和PD提供了重要的分子靶点，为临床AD和PD的防治提供了新策略。

原文链接：https://www.thno.org/v13p1809.htm

中央民族大学硕士生薄雪娜和安徽医科大学（军事医学研究院联合培养）硕士生谢非为共同第一作者。该论文的通讯作者是中央民族大学程金波教授、军事医学研究院袁增强研究员。本项工作得到国家自然科学基金重点项目以及面上项目等项目的联合资助。

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编辑︱王思珍
本文完