Adv Sci︱李韶课题组揭示AQP4通过抑制Nav1.6介导的星形胶质细胞自噬加重脓毒症相关脑病认知障碍

撰文︱黄玥琳，朱丹丹

责编︱王思珍，方以一

脓毒症相关脑病（Sepsis associated encephalopathy，SAE）的主要临床表现之一是认知功能障碍[1, 2]，并与全球发病率和死亡率增加有关，目前，SAE已成为一个重要的威胁人民群众健康，影响社会发展的公共卫生问题，亟待解决。星形胶质细胞自噬水平降低可导致星形胶质细胞活化，炎症因子释放增加[3]，而星形胶质细胞自噬通量上调可提高神经元活性，减少神经元凋亡，改善神经功能。因此星形胶质细胞在SAE神经元损伤中发挥着重要作用。水通道蛋白4（Aquaporin 4, AQP4）是星形胶质细胞高表达的一种水通道蛋白。它不仅是水出入星形胶质细胞的通道，也是启动细胞内信号事件的关键分子，调节星形胶质细胞释放细胞因子，进而影响神经元功能。然而，AQP4在SAE中的蛋白表达水平变化及作用尚不明确。另有研究表明，星形胶质细胞中同样表达细胞膜电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channels, VGSCs）--Na_v1.6，且Na_v1.6的表达在脓毒症患者中有显著的升高[4]。由于SAE相关的潜在病理机制非常复杂，因此进一步探究SAE潜在病理机制，找到靶标蛋白对治疗SAE意义重大。

2023年3月16日，大连医科大学基础医学院李韶课题组在Advanced Science杂志上发表了题为“AQP4 Aggravates Cognitive Impairment in Sepsis-Associated Encephalopathy through Inhibiting Na_v1.6-Mediated Astrocyte Autophagy”的研究论文。首次发现AQP4通过激活Na_v1.6，导致星形胶质细胞内Ca²⁺超载，抑制PPAR-γ/mTOR依赖的自噬进而激活星形胶质细胞的炎症反应，加重脓毒症诱导的神经元损伤和认知功能障碍。该研究为脓毒症所致神经元损伤的病理机制和治疗SAE的潜在新药靶点提供了新的见解。（拓展阅读：李韶团队相关研究进展，详“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：J Neurosci︱李韶/麻彤辉团队揭示水通道蛋白点突变解聚小鼠AQP4正交列阵结构并降低其在星形胶质细胞终足处的极性分布；Aging Cell︱李韶/马全红团队揭示Nav1.6在阿尔茨海默症中的作用及其机制）

以往的研究表明，AQP4可以通过脑源性外泌体分泌到到外周血中，从而在阿尔茨海默病和创伤性脑损伤等中枢神经系统疾病中检测到AQP4的表达上调。因此，AQP4可能是反映脑部炎症变化的一个有用的外周血液生物标志物[5, 6]。然而， AQP4在SAE时外周血中变化尚未明确。

研究者分析了33例SAE患者、27例脓毒症患者和20例健康人的外周血样品，结果显示SAE患者外周血中AQP4含量显著高于脓毒症患者组。结合ROC曲线、Pearson相关性分析等结果，研究者推测AQP4在SAE脑损伤中起着重要作用。为进一步探究AQP4在SAE中的重要作用，研究者通过盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and perforation，CLP）构建SAE小鼠模型，结果显示SAE小鼠皮层、海马AQP4表达明显增加。上述结果表明脓毒症相关性脑病患者外周血和小鼠脑内AQP4表达升高（图1）。

图1脓毒症相关性脑病患者和小鼠脑外周血AQP4表达升高

（图源：Dan-Dan Zhu et al., Adv Sci (Weinh). 2023 ）

既然SAE时AQP4表达增加，那么敲除AQP4是否能够缓解SAE脑损伤呢？研究者采用了AQP4基因敲除鼠进一步探究AQP4在SAE病理过程中的重要作用。他们通过检测SAE小鼠生存率、神经功能评分、脑电以及电生理、行为学、形态学的变化，观察AQP4对SAE小鼠认知功能以及突触可塑性的影响。结果表明敲除AQP4能够提高SAE小鼠存活率，改善认知功能障碍以及突触可塑性，降低星形胶质细胞炎性反应，缓解SAE脑损伤（图2）。

图2 AQP4敲除改善SAE小鼠认知功能障碍及其突触可塑性

（图源：Dan-Dan Zhu et al., Adv Sci (Weinh). 2023 ）

为进一步观察AQP4在SAE病理进程中的具体机制，研究者通过透射电镜、蛋白免疫印迹、免疫荧光等方法观察到敲除AQP4能够激活SAE小鼠星形胶质细胞自噬。有报道，AQP4缺失能够上调PPAR-γ表达并减轻促炎细胞因子的释放，研究者通过体内及体外实验探究了AQP4与PPAR-γ之间的作用关系，结果表明敲除AQP4可激活PPAR-γ-mTOR信号通路依赖的星形胶质细胞自噬（图3）。

图3 AQP4敲除激活SAE小鼠PPAR-γ/ mTOR信号通路。

（图源：Dan-Dan Zhu et al., Adv Sci (Weinh). 2023 ）

研究者团队在此前的研究中发现，Na_v1.6是星形胶质细胞中表达的电压门控钠通道主要亚型之一，且其在调节炎症中发挥着重要作用[7]。Na_v1.6激活产生持续的钠电流，可以驱动反向Na⁺/Ca²⁺交换，将有害水平的钙离子导入细胞质[7, 8]。而Ca²⁺与许多转录因子和调节蛋白的激活相关，包括PPAR-γ[9, 10]。

因此为进一步揭开AQP4是如何调控PPAR-γ-mTOR信号通路的神秘面纱，研究者通过分子对接发现AQP4与Na_v1.6存在两个结合位点，并且激光扫描共聚焦显微镜及CO-IP结果证实了二者的共定位及相互作用。进一步通过蛋白免疫印迹、qPCR、免疫荧光等方法，研究者发现SAE 时Na_v1.6蛋白表达明显增加，而敲除AQP4能够降低Na_v1.6表达，但在mRNA水平上并无明显变化。并且在LPS诱导的星形胶质细胞中显示敲除AQP4能够减轻星形胶质细胞LPS刺激诱导的钠电流增加。LPS诱导的原代星形胶质细胞Ca²⁺的升高依赖于Na⁺内流，敲除AQP4通过抑制钠通道和反向Na⁺/Ca²⁺交换来降低胞内Ca²⁺的升高，激活PPAR-γ入核，从而促进星形胶质细胞自噬，增强抗炎反应（图4）。

图4 AQP4通过Nav1.6调节钠钙交换以抑制LPS诱导的星形胶质细胞PPAR-γ进入细胞核

（图源：Dan-Dan Zhu et al., Adv Sci (Weinh). 2023 ）

星形胶质细胞过度活化可释放炎症因子，进一步损伤神经元，这是神经炎症过程中神经元损伤的原因之一。为观察敲除AQP4对神经元损伤的影响，研究者向原代培养的神经元中加入星形胶质细胞来源的条件培养基，结果显示敲除AQP4可减轻LPS诱导的神经元活力下降，而加入PPAR-γ抑制剂和自噬抑制剂后减轻AQP4敲除的治疗效果。

研究者团队利用研发的专利药物蝎毒耐热合成肽（SVHRSP，Na_v1.6抑制剂）在体给予，结果表明SVHRSP以及AQP4缺失均能减轻SAE中神经元损伤，但当给予了钠通道激活剂（ATXⅡ）后减轻了AQP4敲除的治疗效果。这些结果表明AQP4敲除抑制Na_v1.6，激活PPAR-γ减轻神经元损伤（图5）。

图5 敲除AQP4激活PPAR-γ减轻因Na_v1.6激活引起的神经元损伤

（图源：Dan-Dan Zhu et al., Adv Sci (Weinh). 2023 ）

图6 工作总结图：SAE时AQP4参与病理进程机制图 

（图源：Dan-Dan Zhu et al., Adv Sci (Weinh). 2023 ）

文章结论与讨论，启发与展望

在SAE时外周血以及脑内AQP4表达上调，Na_v1.6激活持续开放，持续钠电流增加，大量Na⁺进入胞内，驱动Na⁺/Ca²⁺反向交换，将有害水平Ca²⁺导入胞内，抑制PPAR-γ入核，从而抑制PPAR-γ-mTOR信号通路依赖的星形胶质细胞自噬的发生，星形胶质细胞炎症反应进一步扩大，造成神经元损伤。

综上所述，敲除AQP4能够减轻因Na_v1.6激活所致的PPAR-γ-mTOR信号通路依赖的星形胶质细胞自噬的降低，从而缓解SAE脑损伤。这项研究为脓毒症诱导的神经元损伤的病理机制和治疗SAE的潜在新药靶点提供了新的见解。然而AQP4调节Na_v1.6的具体机制有待进一步阐明，后续研究工作正在进行。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202205862

文章通讯作者为：大连医科大学基础医学院生理学教研室、大连医科大学神经退行性疾病药物研发国家地方联合工程研究中心李韶教授；大连医科大学神经退行性疾病药物研发国家地方联合工程研究中心、南京中医药大学医学院的麻彤辉教授；大连医科大学附属第二医院重症医学科于健教授。文章第一作者为大连医科大学附属第二医院重症医学科朱丹丹主治医师。共同第一作者为大连医科大学基础医学院黄玥琳。

李韶（左一）；麻彤辉（左二），于健（中）。朱丹丹（右二），黄玥琳（右一）

（照片提供自：李韶教授实验室）

本文受辽宁省教育厅基础科学研究项目(LJKZZ20220097, LJKQZ2021101)、国家自然科学基金项目(82073913, 82101275, 82101661, 81571061, 81671111 and U1908208)、辽宁省自然科学基金(2021-MS-280)、中国博士后科学基金(2022M713090)、大连医科大学附属第二医院1+X项目(2022LCYJYB06)支持。

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参考文献（上下滑动查看）  [1] Thompson, K., B. Venkatesh, and S. Finfer, Sepsis and septic shock: current approaches to management. Intern Med J, 2019. 49(2): p. 160-170.[2] Pandharipande, P.P., et al., Long-term cognitive impairment after critical illness. N Engl J Med, 2013. 369(14): p. 1306-16.[3] Wang, X.S., et al., Activation of G protein-coupled receptor 30 protects neurons by regulating autophagy in astrocytes. Glia, 2020. 68(1): p. 27-43.[4] Ma, T., et al., Generation and phenotype of a transgenic knockout mouse lacking the mercurial-insensitive water channel aquaporin-4. J Clin Invest, 1997. 100(5): p. 957-62.[5] Denver, P., et al., A Novel Model of Mixed Vascular Dementia Incorporating Hypertension in a Rat Model of Alzheimer's Disease. Front Physiol, 2019. 10: p. 1269.[6] Goetzl, E.J., et al., Neuron-Derived Plasma Exosome Proteins after Remote Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma, 2020. 37(2): p. 382-388.[7] Li, X., et al., Scorpion venom heat-resistant synthesized peptide ameliorates 6-OHDA-induced neurotoxicity and neuroinflammation: likely role of Na(v) 1.6 inhibition in microglia. Br J Pharmacol, 2021. 178(17): p. 3553-3569.[8] Annunziato, L., G. Pignataro, and G.F. Di Renzo, Pharmacology of brain Na+/Ca2+ exchanger: from molecular biology to therapeutic perspectives. Pharmacol Rev, 2004. 56(4): p. 633-54.[9] Chuderland, D., et al., Calcium-mediated interactions regulate the subcellular localization of extracellular signal-regulated kinases. J Biol Chem, 2008. 283(17): p. 11176-88.[10] Wiegert, J.S. and H. Bading, Activity-dependent calcium signaling and ERK-MAP kinases in neurons: a link to structural plasticity of the nucleus and gene transcription regulation. Cell Calcium, 2011. 49(5): p. 296-305.


          

编辑︱王思珍
本文完