线粒体功能紊乱和轴突丢失是包括肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等神经退行性疾病发生发展的重要标志[1]。线粒体损伤导致包括线粒体DNA（mtDNA）细胞色素c在内的内容物释放，这些内容物驱动caspase-3活化和细胞凋亡[2]。caspase-3活化也可发生在神经突的局部，并在诱发明显的神经元细胞死亡之前促使轴突损伤[3]。虽然线粒体损伤和caspase-3激活之间的联系已经明确，但在神经突中局部线粒体死亡引发的轴突病变并导致神经元功能障碍的机制尚不完全清楚。因此阐明线粒体应激与轴突变性和神经元死亡之间的分子机制可能会对神经退行性疾病的有更深入的理解。Gasdermins（GSDMs）蛋白是介导炎症和细胞死亡的关键效应分子，包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59。所有GSDMs都由两个不同的结构域组成:C-末端抑制结构域（RD）和N末端效应结构域（PFD），即CT和NT，后者具有细胞毒性。当RD被水解去除，PFD便可与脂质组分结合，在细胞膜上形成孔洞。质膜中GSDM孔的积累导致细胞肿胀和明显坏死，进而引发细胞焦亡[4]。细胞焦亡的发生依赖于炎性caspase和GSDMs蛋白家族，被激活的caspase切割GSDMs蛋白，释放出其N端结构域，该结构域结合膜脂并在细胞膜上打孔，导致细胞渗透压的变化，进而发生胀大直至细胞膜破裂[5]。GSDME是GSDM家族的一员，在脑和脊髓中均有表达。然而，其在中枢神经系统中的作用尚不清楚。近日，美国哈佛医学院和波士顿儿童医院的Isaac M. Chiu和Judy Lieberman团队在Neuron上发表了题为“Gasdermin-E mediates mitochondrial damage in axons and neurodegeneration”的文章，该研究发现Gasdermin-E在神经元特异表达。当用线粒体毒性剂暴露刺激时，GSDME会迅速靶向并破坏线粒体，导致线粒体功能紊乱和轴突破坏。抑制GSDME基因的表达部分恢复了肌萎缩侧索硬化(ALS)患者源性运动神经元的轴突丢失，并改善了ALS模型小鼠的疾病进展。该研究阐明了GSDME是神经元线粒体功能紊乱的关键分子，最终参与介导神经退行性疾病的发生 。为了确定Gsdme的在中枢神经系统的表达以及可能的作用，作者首先对分选的小鼠皮质和海马神经元进行了单细胞RNA-seq分析。结果显示Gsdme在GABA能神经元和谷氨酸能神经元中都有表达。免疫荧光染色以及对野生型(WT)和Gsdme-/-小鼠不同脑区组织样本的蛋白质印迹（Western Blot）也显示gsdme在小鼠皮层和海马以及小脑高表达。为了进一步检测GSDME在大脑的时空表达模式，作者对小鼠大脑的神经元和非神经元细胞组分进行了MACS纯化，通过Western Blot发现GSDME在神经元（Tuj1+）高表达，而在胶质细胞（Iba1+）不表达。皮层和纹状体荧光双标染色也显示，GSDME与神经元标记物Tuj1高度共标，而不与小胶质标记物Iba1共标，证实，与胶质细胞相比，GSDME在神经元特异性富集。用抗gsdme抗体染色人脑颞叶皮质发现GSDME在多个皮质层表达且表达模式与在神经元表达一致(图1)。先前的研究发现，GSDME激活后可被caspase-3切割来介导细胞焦亡[5]。鉴于GSDME在神经元中特异表达，作者接下来探究了使用线粒体毒性剂处理可否会激活GSDME。作者使用了几种线粒体毒素:鱼藤酮（rotenone）和6-羟多巴胺（6-OHDA）(复合物I抑制剂)，抗霉素A(antimycin-A)(复合物II抑制剂)和raptinal(线粒体损伤和caspase-3诱导物)。通过免疫印迹分析，发现用这些线粒体毒性剂处理原代小鼠皮质神经元和人SH-SY5Y细胞会导致全长GSDME裂解为-30 kDa的N端成孔片段。Gsdme KO 原代小鼠神经元相比WT对PI或 Sytox Green的摄取显著降低（PI和Sytox Green为非细胞膜渗透性染料，仅能对死细胞染色）。表明GSDME可以增加原代小鼠神经元和人神经元样细胞系的质膜通透性。对GSDM在细胞内动态研究发现，在对神经元用raptinal处理后，转染的GFP-GSDME先后在远端神经突和近端神经突以及胞体中形成点状结构且远端和近端神经突的GSDME点状结构的出现先于PI摄取(坏死)数小时。这些实验表明：线粒体毒性剂诱导的细胞坏死在皮质神经元中受到GSDME的调控且在细胞死亡前GSDME就已导致局部线粒体损伤和轴突丢失（图2）。图2. GSDME被线粒体毒素激活并导致神经元细胞坏死轴突线粒体的损伤或向远端轴突运输的中断是许多神经退行性疾病的早期步骤，如ALS和FTD等神经退行性疾病在神经元胞体丢失之前便出现早期轴突病变[6]。鉴于GSDME可以在细胞死亡前驱动轴突线粒体损伤，作者研究了神经变性相关蛋白与GSDME的关系。研究者将ALS/FTD相关蛋白TDP-43、PR-50或iRFP对照质粒转染至小鼠皮质神经元，发现TDP-43或PR-50与GFP-GSDME的共表达导致GFP-GSDME点状结构增加，这些点状突起富集在沿神经突的线粒体上。另外，在synapsin-I启动子的控制下，用编码GFP, TDP-43或PR-50的慢病毒处理WT皮质神经元，也导致内源性GSDME在转染后72小时被剪切，表明ALS/FTD相关蛋白可活化GSDME(图3)。为了进一步研究GSDME是否参与了ALS/ ftd相关蛋白在小鼠神经元中引起的神经元功能障碍。用编码TDP- 43、PR-50或GFP的慢病毒处理WT神经元表现出显著的线粒体去极化（TMRM染色缺失），而Gsdme KO细胞的线粒体去极化降低，微管解聚指数减小。这些实验表明，ALS/ ftd相关蛋白依赖GSDME引起GSDME激活、线粒体定位和线粒体去极化。图3. FTD/ALS蛋白引起gsdme依赖性线粒体去极化和神经突丢失接下来，作者利用表达人SOD1G93A转基因(与ALS相关)的小鼠模型中研究了GSDME是否具有功能相关性。作者首先检测了SOD1G93A小鼠在发病不同时间点的脊髓裂解物中GSDME的剪切情况。出生后140天(P140)有症状的SOD1G93A小鼠的脊髓中检测到GSDME被剪切且这一剪切到疾病晚期(P160)进一步增加，表明GSDME可能在SOD1G93A ALS模型中促进疾病进展。敲除Gsdme显著延长了生存期并延缓了疾病进展且雌性小鼠生存期高于雄性小鼠。另外，小鼠抓力实验显示，与SOD1G93A Gsdme WT小鼠相比，SOD1G93A Gsdme KO小鼠的抓力显著提高(图4)。这些结果表明，GSDME影响ALS动物模型疾病进展，敲除GSDME可延缓疾病进展并提高生存率。对脊髓腹角尼氏染色的运动神经元计数表明SOD1G93A Gsdme KO小鼠在P150(疾病晚期)时神经元数量显著高于SOD1G93A Gsdme WT同窝小鼠，表明敲除Gsdme可挽救脊髓运动神经的丢失。这些数据表明，GSDME在ALS小鼠模型中被激活，导致神经元丢失，进而导致运动功能和生存率下降。图4. 敲除Gsdme可挽救ALS小鼠模型SOD1G93A的病理进程图5. 文章总结图：Gasdermin E蛋白介导轴突线粒体损伤和神经退行性变
综上所述，该研究结合发育生物学、细胞生物学及行为学等多种手段，揭示了GSDMs家族成员GSDME在中枢神经系统的表达及与线粒体损伤和轴突丢失之间的因果关系，提示了GSDME激活可能是ALS等神经退行性疾病发生发展的关键机制之一，同时为ALS等神经退行性疾病的治疗研究提供了一个新的切入点。不足之处是本文大量的研究都集中在培养的神经元和细胞系上，这不足以模拟神经系统分子和细胞类型相互作用的复杂性。另外，作者发现Gsdme缺乏在ALS小鼠模型中通过延长小鼠存活时间和运动神经元存活时间起到保护作用，但没有直接证据表明Gsdme驱动的线粒体损伤在体内疾病发病机制中的作用。未来可在体直接评估SOD1G93A Gsdme缺陷小鼠相对于SOD1G93A正常小鼠的线粒体极化状态、轴突完整性等将加强作者的结论。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36917977/转载须知：“逻辑神经科学”团队原创性内容，著作权归“逻辑神经科学”所有，欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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1. Smith, E.F., P.J. Shaw, and K.J. De Vos, The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett, 2019. 710: p. 132933.2. Bock, F.J. and S.W.G. Tait, Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020. 21(2): p. 85-100.3. Baranov, S.V., et al., Mitochondria modulate programmed neuritic retraction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(2): p. 650-659.4. Liu, X., et al., Channelling inflammation: gasdermins in physiology and disease. Nat Rev Drug Discov, 2021. 20(5): p. 384-405.5. Wang, Y., et al., Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature, 2017. 547(7661): p. 99-103.6. Yu, H., et al., Early Axonal Dysfunction of the Peripheral Nervous System Influences Disease Progression of ALS: Evidence From Clinical Neuroelectrophysiology. Front Neurol, 2021. 12: p. 574919.
编辑︱王思珍
本文完