常言道“春困秋乏”，正值春暖花开的季节，许多人可能都在经历白天昏昏欲睡的感觉，事实上我们的睡眠-觉醒节律与大脑内的组胺能神经系统活动密切相关，但是对于组胺能神经系统功能特征的精准解析仍然是领域内的一大难题，我们要如何系统性地对中枢组胺的角色进行剖析并对其加以利用呢？结构决定功能！组胺能神经元以位置非常局限的胞体分布向全脑发射纤维投射调控几乎所有主要脑区。过去的研究针对与中枢组胺相关的环路、脑区、受体进行了大量研究，但仍缺乏一定的系统性，对于其功能的精准分析与理解存在一定局限。近期，来自浙江大学/浙江中医药大学的研究人员从中枢组胺能神经环路的本质出发，首次建立了量化小鼠全脑组胺能神经投射的三维图谱，并对其功能关联性与微观结构特征首次进行了直接分析。本文的研究则为今后一系列系统性的全脑组胺能神经环路功能研究从头完成了部署，具有重要的奠基性作用。2023年3月28日，来自浙江大学/浙江中医药大学的陈忠教授研究团队在国际知名期刊《PNAS》发表了题为“Whole-Brain Mapping of Histaminergic Projections in Mouse Brain”的研究论文。团队长期从事慢性脑病的发病机制与药物靶点开发研究，其中关于组胺能神经系统在中枢神经系统功能与疾病中的作用研究是课题组重要的研究方向，尤其关注不同组胺受体在特定神经环路与细胞类型中在生物学与神经精神疾病发病的精准作用研究（PNAS, 2023a,b; Curr Biol, 2022; Nat Commun, 2014, 2021; J Exp Med, 2021; J Cell Biol, 2019; Pharmacol Ther, 2017）。本研究中，研究人员利用荧光显微断层切片成像（fMOST）技术，结合示踪病毒标记、光遗传学、特异性组胺探针等技术手段，首次重建了三维空间中精准的全脑小鼠组胺能神经投射图谱，并且以量化的形式进行了客观展示以及组胺释放功能关联性验证，此外还首次重建了组胺能神经元单独分离的完整形态，为理解组胺能神经环路的结构特征提供了全新的理念与直接的证据。（拓展阅读：陈忠课题组研究进展，详见“逻辑神经科学”报道：本文末【特别专栏】）组胺（histamine，HA）作为哺乳动物大脑内一种重要的神经递质与神经调质，被认为能调控许多生理学功能，如睡眠觉醒节律、摄食行为、认知与运动功能等，并且与许多病理过程有关，如睡眠障碍、认知障碍与阿尔兹海默症、帕金森症、多发性硬化症，以及精神分裂症等[1-4]。在组胺能神经元或肥大细胞中以L-组氨酸为原料，经组氨酸脱羧酶（Histidine decarboxylase，HDC）催化合成。组胺从囊泡内被转运出细胞后，可作用于H1R、H2R、H3R，对下游核团的活动产生调控作用[5]。组胺能神经元是大脑中唯一的神经元性组胺来源[6]，它们在哺乳动物乃至脊椎动物的进化过程中都高度保守，其胞体只存在于后侧下丘脑，而神经纤维则发射到整个大脑几乎所有的主要脑区，分布的疏密程度则各不相同[7,8]。与传统神经递质如GABA、谷氨酸有所不同的是，神经元性的组胺主要通过一种被称为容积传输或旁分泌的过程进行——由串珠状分布于组胺能神经元轴突上富含组胺囊泡的膨体释放，随后与周围胞外环境中的组胺受体结合，产生下一步的调节效应[9]。因此，建立一个完整而又精细可靠的组胺能神经网络输出图谱，弄清楚轴突纤维的完整分布特征，并分析纤维密度与组胺释放量之间的联系，对于将来进一步研究组胺能神经环路的功能是至关重要的里程碑。本研究中，研究者们首先将课题组自己建立的HDC-CreERT2转基因小鼠与Ai47基因报告小鼠杂交，获得全脑HDC阳性细胞均带有绿色荧光标记的HDC-CreERT2;Ai47小鼠，并对其进行免疫组化染色验证，发现这种标记方式的特异性与全面性都非常可靠（图1A-E），接着研究者利用fMOST对HDC-CreERT2;Ai47小鼠脑内组胺能神经元进行重构与分析，发现小鼠全脑组胺能神经元胞体数量约为左右对称分布的5000个，并精确重构了它们在TMN的空间分布的完整信息（图1F-H）。（图源：Lin, et al., PNAS, 2023）如果这种小鼠能用于组胺能神经纤维的全脑重构研究，那么无疑是最佳选择。然而它并没有能够有效地标记组胺能神经元的轴突结构，因此作者必须选择病毒标记的方式进行全脑神经投射的重构。接下来，作者通过一系列病毒注射与观察确认了AAV-CAG-FLEX-Arch-GFP作为标记全脑组胺能神经纤维的病毒工具，并对其进行了标记特异性验证（图2A-C）。利用fMOST对HDC-Arch-GFPTMN小鼠脑内组胺能神经元胞体与纤维进行重构与分析，发现利用病毒注射的手段能标记全脑约40%的组胺能神经元，通过全脑荧光像素点数量计算，发现其全脑组胺能神经纤维数量与标记胞体数呈线性相关，证明了病毒标记纤维的可靠性（图2D-H）。随后利用全脑三维图像配准技术，研究者们重构了组胺能神经纤维在标准小鼠脑中呈现的三维标准图像，并由荧光像素点计算得到量化的全脑组胺能神经纤维密度，由密度值将其分为密集、中等、稀疏三个组（图2I, J），从而获得了首个标准量化的小鼠全脑组胺能神经投射图谱。（图源：Lin, et al., PNAS, 2023）为了进一步验证组胺能神经纤维密度的生物学意义，作者在密集、中等、稀疏组中分别选取了一个脑区进行功能关联性研究，作者选择了内侧隔核（Medial septal nucleus，MS）、中央杏仁核（Central amygdalar nucleus，CeA）与海马CA3，并将其纤维分布特征的三维效果进行细节展示（图3A-C）。随后作者在HDC-CreERT2小鼠的TMN注射光遗传学病毒AAV-hSyn-DIO-ChrimsonR-mCherry，能够响应黄色激光而选择性激活组胺能神经元的发放，同时在MS, CeA, CA3注射了特异性组胺探针病毒HA1m，能够结合组胺而变构为能被蓝色激光激发绿色荧光的激活状态，用于实时监测组胺浓度变化，结果表明激活组胺能神经元时，纤维密度最高的MS组胺浓度明显上升，而密度中等的CeA上升幅度较小，CA3则几乎没有变化（图3D-N），提示组胺能神经纤维的密度与释放组胺量存在关联性。为了进一步验证组胺能神经纤维密度与小鼠生理功能之间的关系，作者在小鼠厌恶刺激反应的同时记录MS与CA3的组胺浓度变化，并同时记录组胺能神经元的钙活动，结果表明小鼠厌恶刺激反应中组胺能神经元被显著激活，并且MS组胺水平显著上升，而CA3则表现出不稳定的变化趋势（图3O-W），提示在生理反应中组胺能神经纤维的密度与释放组胺量同样存在联系，但在生理状态下的组胺水平变化可能还与非神经元来源的组胺相关，这也在课题组的后续研究计划中。图3 下游组胺能神经纤维密度与组胺释放量存在显著联系（图源：Lin, et al., PNAS, 2023）接着作者利用稀疏标记结合fMOST重构的方式，追踪重建了60个互相清晰分离的组胺能神经元结构，并对其投射纤维进行了基本特性分析与投射方向分析，发现不同的组胺能神经元之间存在较大的投射差异（图4A-J）。随后作者尝试使用自动聚类分析对组胺能神经元群体按照投射趋势进行系统性分类，为此首先计算了不同脑区每个组胺能神经纤维的总长度（图4L, M），并进行自动聚类处理，然而结果显示组胺能神经元群体难以按照投射趋势自动被分类为不同的亚群（图4K），作者猜测这可能是不同组胺能神经元的投射方式互相差异过大导致的，即使在某些脑区的范围内存在相似的投射分布，在整体角度也难以保持始终一致，为验证这一点，研究者们手动挑选出了从TMN出发时神经纤维走向重合度较高的7个组胺能神经元，发现其整体投射趋势确实存在较大差异（附图1），提示组胺能神经投射的分群理解需要其他特殊的方式。（图源：Lin, et al., PNAS, 2023）附图1 初期纤维走向一致的组胺能神经元拥有完全不同的最终投射路径（图源：Lin, et al., PNAS, 2023）由于在早期研究中有研究者认为组胺能神经元向TMN前后投射的神经纤维属于两束不同的群体[10]，因此为了探索组胺能神经元投射群体的潜在分群模式，作者首先选取了位于大脑冠状面中央且分别在TMN前侧与后侧的MS与上丘（Superior Colliculus, SC）作为目标下游，在HDC-CreERT2小鼠的MS与SC分别注射带有不同荧光的逆向追踪病毒AAV-DIO-Retro-mCherry与AAV-DIO-Retro-eYFP，以特异性标记它们的上游组胺能神经元胞体，发现从两个下游追踪到的组胺能神经元群体确实存在显著的分群现象，仅有较低比例的组胺能神经元拥有同时投射到MS与SC的能力（图5A-D）。进一步，利用单独重构并在大脑空间中标准化的60个组胺能神经元结构，作者在单神经元的层面对这个结论进行验证分析，发现投射到MS与SC的组胺能神经元确实存在明显的分群，但胞体的空间位置分布并未发现明显的差异（图5E, G），随后作者对投射至这两个下游的组胺能神经元进行了共投射趋势分析，发现它们的共投射特征也存在显著差异，其中投射至MS的组胺能神经元在大部分主要脑区的投射趋势与整体趋势相近，而在TMN后侧的中脑与后脑等分布较少，而投射至SC的组胺能神经元则相反，在中脑与后脑有着显著更高的共投射趋势（图5F, H-J），这提示组胺能神经元确在结构上存在显著差异并拥有潜在的功能差别。图5 MS与SC存在共投射特征差异显著的不同上游组胺能神经元群体（图源：Lin, et al., PNAS, 2023）总而言之，本课题利用顺行与逆行标记、稀疏标记病毒工具结合转基因小鼠与fMOST等前沿技术，在全脑三维层面重构与分析得到了包含整个组胺能神经系统输出信息的全面且单细胞精度的图谱；同时，结合组胺探针、光遗传学，验证了组胺投射密度与功能之间的相关性，并且使用厌恶刺激反应行为学模式为这一功能的相关性提供了生物学意义。这些发现为将来细致解析组胺能神经环路功能提供了坚实的基础，也为有序剖析以组胺能神经系统为核心的机制研究和精准药物靶点开发提供了潜在的突破口与依据。
在本研究结果的基础上，未来作者将聚焦于不同组胺能下游神经环路的精准功能研究，同时关注组胺能神经元在全脑范围内的关键上游核团展开系统性探索；此外，本研究尚未完全解开组胺能神经元亚群特征，我们还将进行后续更加深入的研究，对于组胺能神经元群体进行基因测序与更大范围的结构特征追踪，以期为中枢组胺能神经系统的全面探究注入最前沿的攻坚力量。
原文链接：www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2216231120
该研究的第一作者为浙江中医药大学博士后/浙江大学药学院博士（已毕业）林文凯，浙江大学药学院博士研究生徐玲钰为共同第一作者，陈忠教授为本文的通讯作者。本研究得到了海南大学校长骆清铭院士与华中科技大学龚辉教授、李安安教授课题组的通力合作，还获得了北京大学生命科学学院李毓龙教授与中国科学院上海生命科学研究院仇子龙教授的大力支持与帮助。
第一作者林文凯（第三排左数第八位），共同第一作者徐玲钰（第一排左数第二位），通讯作者陈忠教授（第二排左数第四位）
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参考文献（上下滑动查看） [1] Panula P, Nuutinen S. The histaminergic network in the brain: basic organization and role in disease [J]. Nat Rev Neurosci, 2013, 14(7): 472-87.
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编辑︱王思珍
本文完