金庸先生笔下的小说曾描述：“毒物周围百步之内，必有解药”，这大抵表达了一种“万物相生相克”的理念。我们的大脑由数以亿计的神经元组成，其处于动态的兴奋-抑制平衡之中，局部神经元“干火柴”的过度兴奋可以直接 “点燃”癫痫的发作。近期，来自浙江大学和浙江中医药大学的研究人员发现，在局部兴奋的神经元“干火柴”周边，有一群内源性起保护作用的神经元“湿火柴”，它们以微弱的数量在延缓癫痫发展进程中发挥着关键的作用。2022年12月13日，来自浙江大学、浙江中医药大学的陈忠/汪仪研究团队在国际知名期刊Cell Reports发表了题为“Interictal period-activated
neuronal ensemble in piriform cortex retards further seizure development”的研究论文。团队长期从事癫痫的发病机制解析与治疗药物靶点的发现研究，前期重点关注癫痫发病中以海马下托为核心的的神经环路“兴奋-抑制”平衡机制与调控治疗策略及药物新靶点研究（Neuron, 2017;
Ann Neurol, 2019, 2021; Biol Psychiat, 2020; Nat Nanotech, 2020; Nat Commun,
2020, 2022a,b; iScience, 2022, Science Adv, 2022）。本研究中，研究人员利用即早基因驱动的细胞标记技术，结合光遗传学、药理遗传学等调控手段，首次揭示了大脑梨状皮层中和癫痫状态相关的两群功能不同的神经元的作用，其中与提出“发作间期”激活的神经元集群可能是未来癫痫治疗的重要时间窗口和治疗靶点。发作间期”相关的一群神经元（“湿火柴”）在延缓癫痫早期发展进程中具有重要的作用，提出“发作间期”激活的神经元集群可能是未来癫痫治疗的重要时间窗口和治疗靶点。（拓展阅读：陈忠&汪仪团队最新进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Nat Commun︱陈忠/汪仪团队揭示星形胶质细胞参与癫痫发作的新机制；Nat Commun | 陈忠团队揭示下托参与颞叶癫痫发病的环路及分子机制；Research︱陈忠团队揭示外侧下丘脑CaMKIIα+神经元调控捕食行为的环路机制；Current Biology︱陈忠团队在组胺调控摄食机制方面取得新成果：H2受体依赖的内侧隔核组胺能回路；Sci Adv︱陈忠团队提出癫痫药物治疗新思路：电响应型聚多巴胺纳米递药系统）癫痫是世界上最早确认的病症之一，可以追溯到公元前4000年的文字记载[1]。作为一种慢性脑疾病，癫痫影响到全球大约5000万人，在中国约有900万癫痫患者[1]。当癫痫患者发病时，其身体某一部位或整个身体短暂非自主抽搐（即部分性发作或全身性发作），有时伴有意识丧失和尿便失禁，因此数世纪以来，人们对癫痫存有恐惧、误解、歧视并视之为社会耻辱，这严重影响到患者及其家庭的生活质量。尽管目前有多种针对离子通道和GABAA受体等靶点的抗癫痫药物被应用于临床控制癫痫发作，但是现有抗癫痫药物均无法根治或预防癫痫，并且约有三分之一的癫痫患者对多种抗癫痫药物耐受而发展为难治性癫痫[2]。癫痫的临床发作症状（从极短暂的意识丧失或肌肉反射到严重且持续性抽搐等）是由大脑内一组脑细胞突发异常放电造成，而大脑的不同部位都可能成为异常放电的位点。癫痫发作具有不可预测、反复性、一过性的特点。临床上，我们常把一次发作到下一次发作之间的这段时期称为发作间期（interictal period）[3]，事实上发作间期占据了癫痫患者的大部分时间段。然而，关于发作间期与发作期之间如何相互转化及影响并不清楚。本研究中，研究者们首先使用即早基因驱动的细胞标记技术（E-SARE），标记了APir脑区中由局灶性癫痫发作（FS-Ens）和发作间期（IP-Ens）所激活的神经元集群。接着在小鼠海马电点燃模型（kindling
model）中，利用在体钙信号记录的手段研究了这两群神经元在局灶性发作（focal
seizure，FS）中的参与情况，结果表明，IP-Ens在FS中钙活动呈下降趋势（图1E-1H），FS-Ens在FS中钙活动显著上升（图1I-1L），提示APir内的IP-Ens和FS-Ens是功能不同的神经元集群，而且IP-Ens不参与FS。图1 E-SARE系统的标记流程及两群神经元的不同钙响应（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）既然这两群神经元在发作事件中的参与情况不同，提示了这两群神经元在某些方面的异质性，因此作者分析了它们神经元类型的组成以及数量、空间位置上的分布，结果表明IP-Ens和FS-Ens主要都是兴奋性谷氨酸能神经元（附图2C-2F）；FS-Ens标记的神经元总数量多于IP-Ens；IP-Ens主要分布在APir的浅层（L2），而FS-Ens主要分布在APir的深层（L3和L4）（附图2G）。附图2 IP-Ens和FS-Ens神经元类型、数量及空间分布
（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）
接下来，作者进一步探索其对癫痫发作的具体作用如何，发现直接用光激活FS-Ens能够诱发癫痫发作，而光激活IP-Ens不能诱发发作，说明这两群神经元的致痫能力不同。有趣的是，激活一小群FS-Ens比激活一大群CaMKIIa阳性的神经元的致痫作用更强（图2），说明FS-Ens可能就是真正导致癫痫发生的致病神经元，并且APir中可能存在其它内在的抗癫痫作用的神经元亚群（猜测是IP-Ens）。（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）为了进一步验“证“IP-Ens可能具有抗癫痫作用”的猜想，作者根据以往“体外诱发间期放电阻止了发作事件的产生”的研究报道[4,5]，摸索出了一套在体提高IP-Ens活动的干预方法，发现提前用光激活APir的IP-Ens显著延缓了癫痫发作的形成进展（图3）。图3 IP-Ens在Kindling模型中具有抗癫痫作用：光激活IP-Ens显著延缓癫痫的形成进展（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）接着作者又反向抑制了IP-Ens，发现其能够促进癫痫的形成进展（图4），说明IP-Ens能够双向调控癫痫的形成过程，证实了其抗癫痫作用的充分必要性。（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）前述工作均是在探究在癫痫形成发展过程中扮演的角色，下一步，研究人员继续探究IP-Ens在癫痫全面性发作（generalized seizure，GS）中发挥的作用。同样在kindling模型中，双向调控IP-Ens对GS没有影响；提前激活IP-Ens也不能发挥抑制大发作的作用（图5）。尽管这是一个“阴性”结果，但却提示了一个很关键的信息：IP-Ens具有干预时间窗效应，当疾病进展到GS后，IP-Ens可能不足以产生治疗作用。（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）接下来，研究人员探究了IP-Ens在GS中的参与情况，他们利用钙信号光纤记录结合c-fos免疫组化的表征，发现IP-Ens参与GS。而之前的（图1）研究结果显示IP-Ens是不参与FS的，那么从FS到GS的进展过程中，IP-Ens发生了什么变化呢？通过逆向追踪病毒示踪方法，分别对IP-Ens在FS及GS后进行上游输入追踪，结果表明，APir的IP-Ens在FS和GS状态下有不同的环路联系，当IP-Ens参与到GS环路时，接受更多的输入（图6），提示IP-Ens在癫痫后期存在神经环路的重组。图6 IP-Ens通过环路重组参与到了癫痫大发作的环路中（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）最后，作者分析了FS以及GS两个发作过程中Pir与CA3两个脑区脑电的同步性，发现提前激活IP-Ens可以降低FS过程中两个脑区的同步性，但是不能影响GS过程中脑区同步性（图7），这部分解释了为什么IP-Ens在GS期间失去了抗癫痫作用。图7 激活IP-Ens可降低FS期间脑区之间的同步性（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）为了让靶向“发作间期激活的神经元集群”的治疗意义更加具有说服力，作者在海人藻酸（KA）诱导的急性癫痫发作模型中进一步验证了这两群神经元的功能（附图4）。结果发现，激活发作响应的细胞集群“Seizure-Ens”，而非发作间期响应的细胞集群“IP-Ens”，可以诱发癫痫发作（附图4D），这与点燃模型中观察到的结果一致（图2）。同时药理遗传激活IP-Ens减轻了癫痫发作的严重程度，表现为延长了癫痫持续状态的潜伏期（附图4E）。这些结果表明IP-Ens作为抗癫痫靶细胞可被应用于多种癫痫动物模型。附图4 IP-Ens在急性KA模型中具有抗癫痫作用：药理遗传激活IP-Ens延长了癫痫持续状态的潜伏期（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）图8：工作总结图：大脑梨状皮层中发作间期激活的神经元系带延缓癫痫发作的进一步发展，因此“发作间期”激活的神经元集群可能是未来癫痫治疗的重要时间窗口和治疗靶点。（图源：Lai,et al., Cell Rep, 2022）综上所述，本研究利用活动依赖病毒标记工具同时结合基因编码的效应器特异性地标记、可视化和操纵APir中和癫痫状态相关的两群功能不同的神经元，发现APir的FS-Ens介导了癫痫的发生和扩散，这群神经元可能是致痫网络的一部分。然而，APir的IP-Ens可能是一群内在的“自我修复”神经集群，是大脑在早期发作后启动的一个保护机制，激活它们可以通过对局域癫痫网络的去同步化从而延缓癫痫的早期进展。这好比大脑内数以亿计的神经元是一根根火柴棒，本研究中用到的“optogenetic kindling model ”模型中的kindling译为“点燃 ”，蓝光就是那把火， FS-Ens像一把“干火柴 ”，极易被“点燃 ”兴奋引发异常同步化发作放电，而IP-Ens像一把 “湿火柴 ”，不会被“点燃 ”致发作，同时还兼具“灭火作用 ”。总之，本研究揭示了APir不同活动反应亚群在癫痫发作中的作用，并提示发作间期激活的神经集群可以作为预防癫痫发作的潜在靶点。
未来的方向包括在其他更具有临床代表性癫痫动物模型中、以及其它脑区中测试“间期神经集群 ”的抗癫痫作用，并且精确表征发作间期中不同时间段激活神经元集群的事件，从而为更好的临床转化治疗奠定基础。
原文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01686-2
该研究的第一作者为浙江大学药学院的博士研究生赖南希，及浙江中医药大学的程鹤鸣博士后。陈忠教授和汪仪研究员为本文的通讯作者。
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