PNAS︱新技术-新发现-新想法：李毓龙/罗敏敏团队揭示“睡眠因子”腺苷的释放及调控机制

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撰文︱武照伐责编︱王思珍，方以一

腺苷清醇独具香，静静慢嚼细品尝。

促进记忆提神醒，疲劳困顿快速扛。

血管扩张降压力，心脏健康喜乐长。

腺苷滋补人体好，生活美好心情爽。

——七言律诗，作者：ChatGPT

腺苷（Adenosine，Ado）是一种重要的信号分子，在睡眠、学习记忆、心血管功能及免疫反应等过程中发挥着重要作用。异常的腺苷信号往往伴随着疼痛、癫痫、中风及神经退行性疾病[1]。早在1929年，Alan Drury和Albert Szent-Györgyi（1937年诺奖获得者）发现，把腺苷类化合物注射到豚鼠中，1-2分钟后豚鼠变得“呼吸急促、无精打采，倾向于安静地躺着、偶尔睡着”，这提示腺苷可能具有调控神经系统的功能[2]。1974年，John Phillis等人发现，胞外的腺苷能够显著地抑制神经元发放动作电位[3]；咖啡因、茶碱均可阻断腺苷信号通路，从而起到提神醒脑的功能。尽管科学家对胞外腺苷的功能研究已经非常深入，然而对于腺苷释放如何被调控这一问题，始终存在争议。

2023年3月30日，北京大学李毓龙团队联合北京脑科学与类脑研究所罗敏敏团队在PNAS杂志在线发表了题为“Neuronal activity-induced, equilibrative nucleoside transporter-dependent, somatodendritic adenosine release revealed by a GRAB sensor”的研究论文。在这项研究中，作者利用新型GRAB荧光探针，详细地研究了神经元活动引发腺苷释放的细胞及分子机制，并揭示了一种非经典的神经调质释放模式。（拓展阅读：李毓龙课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：本文末【特别专栏】）

胞外腺苷来源的争议可以归结为以下几个方面：（1）在细胞水平上，腺苷是来源于神经元还是相邻的胶质细胞？（2）腺苷释放是否具有亚细胞结构的特异性，从突触前还是突触后释放？（3）在分子水平上，腺苷是通过胞外的三磷酸腺苷（ATP）的降解产生；还是通过核苷转运蛋白或突触囊泡直接被释放？

研究胞外腺苷的来源、释放及调控机制的难点在于缺乏可视化检测腺苷的方法。2020年，李毓龙团队和徐敏团队联合报道了一种基于G蛋白偶联受体激活原理（GRAB）的胞外腺苷荧光探针GRAB-Ado1.0 [4]，Ado1.0对胞外腺苷的亲和力是~60 nM。在本次报道的研究中，为了进一步扩展探针的检测范围，作者首先通过筛选得到了一个~3.2μM的低亲和力版本Ado1.0m，该探针表现出更大的响应幅度（大于300%）和对腺苷的高特异性。

利用新版Ado1.0m探针，作者成功地在海马急性脑片CA1位置检测到电刺激引发的胞外腺苷水平的上升。有趣的是，作者发现阻断CA3到CA1的谷氨酸突触传递只能部分阻断胞外腺苷水平的上升。那么胞外的腺苷是来源于CA1局部的胞体树突（突触后）还是CA3的轴突投射（突触前）？结合光遗传学工具和胞外腺苷成像，作者发现在阻断谷氨酸突触传递的基础上同时激活CA3轴突，并不能引发腺苷释放；而当激活CA1胞体树突时则发现，胞外腺苷水平表现出刺激时长依赖的增加（图1）。以上结果表明，在亚细胞水平上，胞外腺苷主要来源于CA1的胞体树突（突触后）。

图1：激活CA1胞体树突引发胞外腺苷水平的上升

随后，作者使用培养的海马神经元体系研究胞外腺苷来源的分子机制。结合GRAB腺苷探针、谷氨酸探针及药理学、遗传学等手段，作者发现：在细胞水平上，通过电场刺激能够引发腺苷的释放，而当通过河豚毒素、氯化镉分别阻断表达在神经元上的电压敏感的钠离子和钙离子通道时，腺苷的释放也被阻断，表明胞外的腺苷来源于神经元；当激活星形胶质细胞时，则没有检测到胞外腺苷水平的上升。进一步地，作者还发现胞外腺苷水平的上升主要依赖于的L型钙离子通道，胞内钙库的激活也能引发腺苷的释放。

分子水平上，破伤风神经毒素能够有效地阻断突触囊泡释放的谷氨酸，却无法阻断腺苷的释放，表明腺苷的释放不依赖于SNARE蛋白介导的胞吐过程；阻断CD39或者敲除CD73（胞外ATP降解成腺苷的限速酶）对胞外腺苷的释放没有明显的影响，表明CD39-CD73介导的胞外ATP降解途径对电刺激引发的腺苷释放贡献不大；有意思的是，通过药理学手段阻断或者遗传学手段敲除细胞膜表达的平衡核苷转运蛋白（ENTs），大部分腺苷的释放被阻断，表明在神经元被激活时，胞外腺苷水平的上升主要依赖于ENT转运蛋白（图2）。

图2：神经元活动引发腺苷释放的模式图

文章结论与讨论，启发与展望

综上，作者发现在海马中神经元活动诱导的胞外腺苷升高主要是由神经元释放的，并取决于ENTs，而不是通过传统的囊泡释放机制；与经典神经递质相比，胞外腺苷积累缓慢（约40秒）并且需要L-型钙离子通道。重要的是，作者发现腺苷主要由突触后直接释放，而不是突触前；基于在突触前膜有丰富的腺苷受体表达，表明突触后释放的腺苷是一个潜在的逆行调控分子（图2）。由于腺苷信号传递及其代谢参与多种生理（睡眠-觉醒调控等）及病理过程（癫痫、中风、疼痛、帕金森病，乃至肿瘤发生等），这项基础研究为理解腺苷的作用机理提供了重要参考，也为腺苷相关疾病的治疗提供了潜在的药物靶点。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2212387120

武照伐博士、崔玉婷博士和王欢博士为本文的共同第一作者，李毓龙教授和罗敏敏教授为共同通讯作者，吴昊、万逸博士、李柏翰、王蕾、潘孙磊、彭婉玲博士、董傲博士、袁正巍博士和井淼博士等对前期探针的开发和刻画做出了重要贡献。论文的合作者还包括中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心的徐敏研究员，并得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、北京大学IDG麦戈文脑科学研究所、国家自然科学基金、北京市科委、生命医学峰基金、新基石研究员项目、科技创新2030-“脑科学与类脑研究”青年科学家项目、勃林格殷格翰博士后基金和北京市科协“青年人才托举工程”等机构、经费和项目的大力支持。更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/；罗敏敏实验室工作详见：https://www.cibr.ac.cn/science/team/detail/36。此外，李毓龙实验室和罗敏敏实验室诚聘不同学科背景的副研究员、博士后以及科研助理，待遇从优，欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入。

李毓龙实验室合影，李毓龙（第一排左三），武照伐（第三排右四）、王欢（第二排左三）。

（照片提供自李毓龙/罗敏敏团队）

罗敏敏实验室合影。罗敏敏（后排左十），崔玉婷（后排右五）
（照片提供自李毓龙/罗敏敏团队）

特别专栏：李毓龙题组进展报道【1】Neuron︱北大李毓龙团队利用新型GRAB探针，解析组胺在睡眠-觉醒过程中的动态变化【2】Neuron︱李毓龙团队发现五羟色胺调节关联学习记忆的时间窗口，揭开巴甫洛夫留下的百年之谜【3】Nat Biotechnol︱李毓龙实验室开发新型催产素荧光探针，揭秘神经肽的时空动态调控【4】Nat Rev Neurosci 综述︱李毓龙团队应邀撰写神经递质检测新技术的研究综述
【5】Neuron︱李毓龙实验室开发新型荧光探针用于检测胞外ATP的时空动态变化

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【2】会议通知︱2023年成瘾与脑科学国际研讨会暨中国药物滥用防治协会成瘾与脑科学分会第一届学术会议（2023年4月9-10日，深圳）【3】会议通知︱2023中国衰老科学大会第一轮通知（2023年4月21-23日，北京）【4】会议通知︱中国神经科学学会神经影像学分会2023学术年会（2023年5月19-21日，广州）【5】学术会议预告︱Novel Insights into Glia Function & Dysfunction（2023年4月24-28日，日本）【6】会议通知︱第六届中国神经科学学会神经退行性疾病分会年会会议通知（2023年4月7-9日，湖南长沙）【7】会议通知更新︱小胶质细胞生理与病理功能专题国际研讨会（2023年3月30-4月1日，深圳）          
参考文献（上下滑动查看）  
1 Chen, J. F., Eltzschig, H. K. & Fredholm, B. B. Adenosine receptors as drug targets--what are the challenges? Nat Rev Drug Discov 12, 265-286, doi:10.1038/nrd3955 (2013).2 Drury, A. N. & Szent-Gyorgyi, A. The physiological activity of adenine compounds with especial reference to their action upon the mammalian heart. J Physiol 68, 213-237, doi:10.1113/jphysiol.1929.sp002608 (1929).3 Phillis, J. W., Kostopoulos, G. K. & Limacher, J. J. Depression of Corticospinal Cells by Various Purines and Pyrimidines. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 52, 1226-1229, doi:10.1139/y74-162 (1974).4 Peng, W. et al. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science 369, doi:10.1126/science.abb0556 (2020).
          

编辑︱王思珍
本文完