Sci Adv︱杨雄里院士团队揭示自感光视网膜神经节细胞–中央杏仁核环路介导明亮光照诱发的小鼠持续性焦虑样行为

撰文︱陈俊茹，王阁，翁史钧责编︱王思珍，方以一

焦虑（anxiety）本质上是一种有益的适应性反应，能促使机体对潜在的威胁进行评估，从而保持警觉，提高生存几率。然而，对外源性或内源性刺激的过度畏惧、不安及表现出回避行为，则构成焦虑症（anxiety disorder），是当今患病率最高的精神障碍，影响全球人口的7.3%[1]。越来越多的证据表明，焦虑水平受到光的调制：光照条件（如强度、时程、波长等）的慢性、长期改变，会显著影响人类及实验动物的焦虑水平；此外，少量工作还表明，急性的强光处理亦促使动物出现焦虑样行为，但其机制尚不明晰。视网膜是光信号神经处理的起点，被认为在光对焦虑水平的调制中具有重要作用。近年来，杨雄里院士团队围绕一种特殊的视网膜神经元——自感光视网膜神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cell, ipRGC）展开了深入研究，取得了一系列成果（Liu et al., Sci Adv, 2022; Chen et al., Diabetes, 2021; Zhou et al., J Neurosci, 2021）。ipRGC表达一种特有的视色素——视黑质（melanopsin），是在视网膜上发现的第三类感光细胞，能不依赖视杆和视锥而直接对光产生反应[2, 3]，其轴突投射至多个脑区，介导非成像视觉功能，如昼夜节律和瞳孔对光反射等[4, 5]。最近，国内外研究小组的工作相继显示，ipRGC通过直接或间接地向多个中枢脑区提供光信号输入，参与光对各种复杂高级功能，如睡眠[6]、学习记忆[7, 8]和情绪[9, 10]的调节。值得注意的是，关于短时程的强光暴露是否足以诱发持续性的、且在光刺激撤除后依然存在的焦虑样行为，及ipRGC是否及如何参与上述光促焦虑效应，目前尚无定论。

2023年3月22日，复旦大学脑科学研究院杨雄里院士团队在《科学·进展》（Science Advances）上发表了题为“Short-term Acute Bright Light Exposure Induces a Prolonged Anxiogenic Effect in Mice via a Retinal ipRGC-CeA Circuit”的研究论文。此项工作阐明了ipRGC向中央杏仁核（CeA）的投射在急性明亮光照诱发的小鼠持续性焦虑样行为中的作用，且揭示了焦虑症干预的新型潜在靶点。博士研究生王阁为论文第一作者，杨雄里院士、翁史钧研究员为论文共同通讯作者。（拓展阅读：杨雄里院士团队组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Sci Adv︱杨雄里院士团队揭示自感光视网膜神经节细胞在近视形成中的重要作用）

关于光照对情绪功能影响的工作，大多仅涉及长期光照变化（例如循环光照模式的异常及光剥夺等）所导致的慢性作用[7, 11]；相反，对于短时光照变化引起的急性影响及其作用机制，目前所知不多。作者在C57BL/6小鼠昼夜节律中的活动相（CT14-17）施加25分钟的急性白光照射后，使之回归黑暗环境，随即进行行为学测试，检测其情绪功能的变化（图1 A-C）。旷场实验（OFT）和高架十字迷宫（EPM）的结果显示，急性光照导致了光强依赖性的促焦虑效应；当光强为1000 lux时，小鼠进入中央区（OFT）和开放臂（EPM）的时间及次数均显著减少，但并未引起运动抑制。作者继而在1000 lux的25分钟光照中止后的不同时间点进行OFT和EPM测试，研究了上述光促焦虑效应的持续性。与黑暗组相比，光暴露组在光照撤去20 min后，依然呈现更为强烈的焦虑样行为（图1 D, E）。出乎意料的是，在EPM中，即使在光照中止1小时后，光暴露组进入开放臂的次数仍然显著低于黑暗组（图1 E）；光照中止2小时后，两组的所有焦虑相关行为学参数均具接近（图1 D, E），表明此时促焦虑效应已经消失。

图1 短时程的急性明亮光照在C57BL/6小鼠诱发持续性焦虑样行为

（图源：G. Wang,et al., Science Advances, 2023）

光照对脑高级中枢的影响，依赖于视网膜感光细胞的光电转换功能。视网膜存在两条感光途径，一条依靠视杆和视锥这两类常规光感受器，另一条则由ipRGC通过其所含的视黑质直接感光。为探索前述的强光暴露所致的持续性焦虑样行为是由哪条视网膜感光途径介导的，作者通过多种遗传学小鼠，结合药理学操作进行了研究。在腹腔注射MNU从而引起视杆和视锥大量凋亡的C57BL/6小鼠(图2 A-G)，OFT和EPM结果显示光促焦虑效应依然存在(图2 H, I)，且该结果在视杆、视锥均几乎完全退变消失的rd/rd cl突变小鼠上得到了重复(图2 J, K)。上述结果提示，基于视杆-视锥系统的视网膜常规感光通路，对急性强光暴露导致的小鼠持续性焦虑样行为的贡献微弱。

图2 明亮光照所致的持续性促焦虑效应不依赖于视杆/视锥信号

（图源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

另一方面，在视黑质被选择性敲除的Opn4^–/–小鼠中，未观察到前述的强光诱发焦虑样行为的效应（图3 A-C)，这提示该效应具有视黑质依赖性，也暗示具有视黑质感光通路的ipRGC可能是为该效应提供光信号的视网膜感光神经元。为检验这一推断，作者使用一种特异性损毁ipRGC的免疫毒素melanopsin-saporin（SAP），对C57BL/6小鼠进行双眼眼内注射后，再进行行为学实验，并以注射PBS（SAP溶剂）的动物作为对照。OFT和EPM实验表明，当绝大部分ipRGC被损毁后，1000 lux明亮光照诱发的焦虑样行为消失，这与Opn4^–/–小鼠的结果类似（图3 D-F)。上述这些结果综合提示，视黑质驱动的ipRGC对明亮光照信号的编码，在前述的光促焦虑效应中具有关键的作用。

图3 视黑质敲除和ipRGC损毁均消除了强光诱发的持续性焦虑样行为

（图源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

接下来，作者对短时明亮光照诱发小鼠持续性焦虑样行为的中枢机制展开了探索。首先，对已知的和焦虑相关的多个脑区，在25分钟1000 lux光照后，进行了c-fos表达水平的定量检测，初步筛选出了数个潜在的参与光促焦虑效应的脑区（图4 A,B）。在这些脑区中，CeA尤为引人注意——既往的顺行示踪研究显示，该脑区受到少量ipRGC轴突的支配[12]。接着，作者在ipRGC被红色荧光特异标记的Opn4^Cre/+; Ai14小鼠的CeA，进行了示踪剂CTB-488的立体定位注射；结果表明，视网膜上被逆行标记的神经节细胞数目尽管不多，但大部分（近80%）为ipRGC，从而确认了存在ipRGC至CeA的直接投射（图4 C,D）。继而，借助病毒转染进行的化学遗传学操纵实验表明：在CeA注射AAV-hSyn-hM4Di-EGFP并以CNO处理小鼠，从而压抑C57小鼠CeA的活动，可阻断前述的光促焦虑效应（图4 E-H）；此外，在Opn4^Cre/+小鼠CeA注射Cre依赖性的逆行病毒AAV-retro-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry，CNO处理后能选择性激活投射至CeA的ipRGC，而这一操作显著提升了黑暗中小鼠的焦虑水平（图4 I-L）。这些结果充分表明，ipRGC–CeA的直接投射环路在强光诱发的持续性焦虑样行为中扮演了重要角色。

图4 ipRGC-CeA投射参与明亮光照诱发的持续性促焦虑效应

（图源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）

在本工作的最后，作者初步研究了皮质酮（CORT）这一与内态平衡和应激状态相关的重要激素[13]在光促焦虑效应中的作用。酶联免疫吸附分析（ELISA）结果显示，在25分钟1000 lux光照后，小鼠血清和脑脊液的皮质酮水平均无显著变化（图5 A, B）。然而，对不同脑区样本的定量免疫印迹分析显示，CeA和终纹床核（BNST）的糖皮质激素受体（GR）及其磷酸化形式（p-GR）的蛋白表达水平均显著升高（图5 C-E）。此外，皮下注射GR特异性拮抗剂RU486后，小鼠在OFT和EPM中进入中央区/开放臂的次数及停留时间均不再因光照而减少（图5 F, G），即RU486完全消除了强光诱发的促焦虑效应，强烈提示该效应的产生与皮质酮系统活动的提升有关。

图5 阻断糖皮质激素的作用消除强光诱发的持续性焦虑样行为（图源：G. Wang, et al., Science Advances, 2023）
图6 工作总结图：短时强光暴露通过ipRGC–CeA环路引起小鼠持续性焦虑样行为（图源：https://iobs.fudan.edu.cn/6c/e3/c17248a486627/page.htm）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究应用多学科技术，研究了强光在焦虑水平调制中的作用及其视网膜、中枢机制（图6）。实验表明：急性施加的短时明亮光照使小鼠产生持续性的焦虑样行为，而这一效应对光信号的检测，是由视黑质光转导所驱动的ipRGC的兴奋介导的。对其中枢机制的初步探索显示，ipRGC–CeA的直接投射环路在上述的持续性焦虑样行为中起了关键作用。进一步工作则揭示皮质酮系统活动水平的提高在其中也扮演了重要角色。

然而，该论文尚留下了一些未能解答的问题。例如，目前尚不能确定究竟是哪一种或几种亚型的ipRGC在这一促焦虑效应中发挥作用。因为M1型ipRGC中视黑质含量最高，也因而最易被SAP损毁，且已被证明投射至多个与情绪调控相关的脑区，作者猜测该亚型很可能提供了强光促焦虑效应的主要视网膜驱动源。在未来工作中，使用特定亚型ipRGC损毁或激活的遗传学小鼠[14]开展实验，将为最终解决这一问题提供有力线索。又如，除CeA外，尚有SCN、BNST、vLGN等其它接受ipRGC投射的脑区，在焦虑情绪调制中起一定作用[15-18]，且这些脑区与CeA间还可能存在复杂的相互作用；这些脑区是否及如何参与该工作观察到的光促焦虑效应，也有待在今后的研究中，通过设计更为精巧的实验加以检验。
综上所述，这项工作系统地阐明了由一类特定视网膜神经元起始的视觉神经环路在焦虑水平调制中的重要作用，为研究病理性焦虑的机制和干预策略提供了新思路，并可能为一系列视觉相关的神经精神疾病的诊疗提供了一个潜在的新靶点。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf4651  

第一作者王阁（前排左四），通讯作者杨雄里（前排左五），通讯作者翁史钧（前排右一）

（照片提供自：杨雄里实验室）

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【3】会议通知︱2023年成瘾与脑科学国际研讨会暨中国药物滥用防治协会成瘾与脑科学分会第一届学术会议（2023年4月9-10日，深圳）【4】会议通知︱2023中国衰老科学大会第一轮通知（2023年4月21-23日，北京）【5】会议通知︱中国神经科学学会神经影像学分会2023学术年会（2023年5月19-21日，广州）【6】学术会议预告︱Novel Insights into Glia Function & Dysfunction（2023年4月24-28日，日本）【7】会议通知︱第六届中国神经科学学会神经退行性疾病分会年会会议通知（2023年4月7-9日，湖南长沙）          参考文献（上下滑动查看）  
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编辑︱王思珍
本文完