hLife Article | 蛋白质靶向编辑技术研发：成功实现新冠病毒刺突蛋白N-糖基化位点特异性编辑

论文亮点

该研究开发了一种基于肽:N-糖苷酶的靶向蛋白质编辑技术，实现了在哺乳动物细胞中直接编辑目标糖蛋白的N-糖基化修饰位点，去除了天冬酰胺残基上连接的糖链并把天冬酰胺残基脱酰胺为天冬氨酸，导致蛋白质序列发生变化，进而影响蛋白质的功能、定位和稳定性（图1）。

图1 基于肽:N-糖苷酶的靶向蛋白质编辑技术

论文导读

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光研究团队在hLife上发表了题为 “Development of targeted protein editing technique in living mammalian cells by peptide-fused PNGase” 的研究论文。该研究开发了一种靶向N-糖蛋白的蛋白质编辑技术，实现了在哺乳动物细胞中直接编辑目标蛋白的N-糖基化修饰位点，去除糖链的同时将同一位点处的天冬酰胺残基修改为天冬氨酸。尤其是LCB1-PNGF对新冠病毒刺突蛋白（Spike）的靶向编辑，使其因失去N-糖基化修饰而更易被蛋白酶体降解，并且显著降低了合胞体的形成和假病毒侵染效率。

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在基因组和转录组水平基于CRISPR／Cas9技术驱动的各种基因编辑技术发展迅速，但是作为遗传信息的最终执行者，蛋白质的编辑技术研究尚处于起步阶段。众所周知，生物体内含有大量的N-糖基化修饰蛋白，包括许多细胞膜蛋白和分泌蛋白。这种翻译后修饰在多种生物学功能中起着至关重要的作用，例如蛋白质折叠和稳定性、细胞间通信、膜蛋白质运输、病原体入侵以及免疫反应。本研究探索开发了一种靶向N-糖基化修饰的蛋白质编辑方法，通过整合高亲和力小肽和不同物种来源的肽:N-糖苷酶（简称为PNGase）, 能够在活体细胞中对目标糖基化蛋白质进行编辑，同步实现N-糖链的去除和氨基酸残基的转换（从天冬酰胺到天冬氨酸）。研究选择了三种膜蛋白质（程序性细胞死亡蛋白-1［PD-1］、程序性细胞死亡蛋白-1配体1［PD-L1］、严重急性呼吸综合征冠状病毒2［SARS-CoV-2］刺突蛋白Spike protein）作为测试对象。

该研究表明，在哺乳动物活细胞内，来源于米氏伊丽莎白假单胞菌（Elizabethkingia miricola）的高活性PNGase F（简称为PNGF）能够有效去除三种目标糖蛋白天冬酰胺残基的N-糖链，并将该位点修改为天冬氨酸，而来自于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）经过截短改造后对天然N-糖蛋白具有活性的PNG1（简称为ScPNG1ΔH1）在37 ℃活细胞内活性较低（图2）。在融合对Spike蛋白具有高亲和力的小肽LCB1后，LCB1-PNGF和LCB1-ScPNG1ΔH1对于目标Spike蛋白均发挥出了更优的编辑效果，造成了更多天冬酰胺残基位点的去糖基化脱酰胺，说明靶向肽的特异性增强了编辑器的靶向活性（图2）。这种编辑方法普遍破坏了三种目标糖蛋白PD-1，PD-L1和 Spike蛋白的蛋白质稳定性，加速了其通过蛋白酶体途径的降解过程（图3）。最终，LCB1-PNGF对于Spike蛋白的靶向编辑明显减少了合胞体的形成并且极大地抑制了假病毒侵染宿主效率（图4）。

图2 蛋白质编辑器对目标N-糖蛋白PD-1，PD-L1和Spike蛋白的编辑效果验证

图3 靶向蛋白质N-糖基化编辑破坏了蛋白质稳定性并且加快降解过程

图4 LCB1-PNGF对Spike蛋白的编辑显著降低合胞体形成并抑制假病毒侵染宿主效率

这种蛋白质编辑技术的开发，实现了在活细胞中直接编辑目标糖蛋白的N-糖基化修饰位点，将有助于解析蛋白质N-糖基化修饰功能和开发新型蛋白质降解技术。目前的编辑工具尚存在诸多不足之处，未来的研究将致力于在提高靶向活性和降低脱靶毒性之间取得平衡，最终实现对靶标蛋白的在体精准编辑、功能解析和操控。

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作者简介

武敏 博士后

第一作者 

机构：中国科学院天津工业生物技术研究所

研究方向：底层通用性蛋白质编辑技术的开发，实现蛋白质精准编辑、功能解析和操控

白桂杰 科研助理

第一作者

机构：中国科学院天津工业生物技术研究所

研究方向：蛋白质编辑技术研发

田朝光 研究员

通讯作者

机构：中国科学院天津工业生物技术研究所

研究方向：蛋白质表达系统和生物质一步转化大宗化学品应用基础研究

引用格式：

Wu M, Bai G, Zhang Z, et al. Development of targeted protein editing technique in living mammalian cells by peptide-fused PNGase. hLife.

https://doi.org/10.1016/j.hlife.2024.07.003

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