呼吸道菌群在呼吸机相关性肺炎中作用的研究进展
呼吸机相关性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）是指暴露于有创机械通气至少48 h后发生的肺实质感染，大约5%~40%的有创机械通气患者会发展为VAP，全因病死率可达50%，其中由感染导致的死亡占比为25%[1]。目前已有研究表明，机械通气患者的呼吸道菌群与宿主免疫系统的互作体系广泛参与了VAP的发生发展[2，3]。一方面，呼吸道菌群的组成和丰度的改变与VAP的发生风险有关[4]。一项回顾性研究显示，VAP组患者发病前菌群多样性较非VAP组下降，普氏菌属和韦荣球菌属等共生菌较非VAP组减少[5]。另一方面，呼吸道菌群能够通过预激活固有免疫系统和短链脂肪酸等代谢物影响呼吸道菌群的稳态，从而影响VAP的发展。有研究报道，鼻腔灌洗液中普氏菌属产生的脂酶、棒状杆菌属可促进亚麻酸水平升高，且与正向免疫调节有关，并间接帮助了对肺炎链球菌的清除[6，7]。由此可见，调节呼吸道菌群或能早期预防VAP的发生及改善预后，现对呼吸道菌群在VAP中的作用进行综述。
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1 呼吸道菌群在VAP中的变化
下呼吸道无菌的概念随着16S rRNA等测序方法的广泛应用而逐渐被推翻[8]。目前认为下呼吸道存在菌群，主要由普氏菌属、韦荣球菌属和链球菌属组成[9]。下呼吸道是外界气体交换的场所，同时受上呼吸道及消化道液体的影响，故下呼吸道菌群的组成处于一个动态平衡之中，即上、下呼吸道菌群分布存在"地貌连续性"，仅有含量而无明显组成的差别[10，11]。
一方面，VAP的发生与患者呼吸道菌群多样性下降和致病菌优势生长有关。Zakharkina等[12]研究发现，菌群多样性随着机械通气时间延长而下降；与未感染的机械通气患者相比，VAP患者菌群结构明显不同，且不动杆菌属、假单胞菌属和伯克霍尔德菌属等常见VAP致病菌含量增多与该结构差异密切相关。另有研究显示，随着VAP的发展和菌群多样性的下降，上述菌属所隶属的变形菌门占比则呈现逐渐上升的趋势（从1 d的25%升高至3 d的55%） [13]。同样，在感染了鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的VAP患者中，呼吸道菌群多样性明显下降，同时普氏菌属、韦荣菌属等常见共生菌含量明显减少，克雷伯杆菌属和假单胞菌属等VAP常见致病菌含量则出现上升[2，3]。呼吸道菌群多样性和结构的失衡会进一步影响机械通气宿主的临床预后。Cifuentes等[9]针对包括VAP患者在内的机械通气患者的研究显示，死亡组（n＝42）与生存组（n＝56）的菌群多样性存在明显差异，其中殊异韦荣球菌和小类杆菌在生存组中含量更高。
另一方面，呼吸道致病菌代谢物也与VAP的发生发展密切相关。一项蛋白组学分析显示，在VAP患者支气管吸取物和肺泡灌洗液中检测到的细菌肽及相关蛋白主要属于变形菌门，并以肠杆菌科和假单胞菌科为主；值得注意的蛋白包括参与脂质还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）合成的苹果酸酶、合成苹果酸的异柠檬酸裂合酶和醛糖脱氢酶，同时脂类代谢物酰基肉碱、甘油磷脂和鞘磷脂在VAP发病期间下降，说明VAP患者呼吸道菌群失衡可能与脂代谢紊乱有关[14]。
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2 呼吸道菌群失衡对宿主免疫的影响
VAP患者呼吸道菌群失衡与免疫系统失调密切相关。Fenn等 [15] 对VAP患者肺泡灌洗液进行分析发现，呼吸道菌群失衡、多样性下降与宿主天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）介导的白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）表达有关。同时，致病菌优势生长也加速了呼吸道菌群失衡和宿主免疫系统紊乱。Xiao等[3]对鲍曼不动杆菌感染的VAP患者呼吸道菌群进行共存网络分析发现，未感染者致病菌含量较低，菌群间以正向共存关系为主，如鲍曼不动杆菌和普氏菌属等呼吸道共生菌仍存在共存关系；而定植者和感染者中致病菌含量明显升高，菌群共存关系明显减少，此时感染者支气管吸取物中致病菌免疫入侵基因表达上调，并伴随宿主氧化应激通路和免疫缺陷相关通路水平上调。说明菌群共存关系失衡可能参与了VAP患者免疫紊乱的进展。
2.1 呼吸道菌群结构对宿主免疫的影响：
肺部感染的发生与呼吸道菌群结构紊乱有关，主要表现为共生菌群减少及单一致病菌优势生长，而呼吸道共生菌群在抵抗肺部感染发生的过程中具有重要作用。首先，特定呼吸道共生菌结构对固有免疫系统广泛的预刺激起到了重要的作用。Wu等[16]研究发现，吸入人体口腔共生菌混合物（含产黑色素普氏菌、小韦荣球菌和缓症链球菌）后，可通过短期诱导以产IL-17 T细胞为主的依赖髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的免疫反应促进对小鼠肺炎链球菌的清除；此外，在吸入该菌群混合物14 d后，给予半数致死量或致死量肺炎链球菌小鼠的存活率均较未吸入菌群混合物小鼠得到明显提高（半数致死量：100%比40%，致死量：100%比0%）；同时，研究者观察到吸入菌群混合物14 d时辅助性T细胞（helper T cells，Th1、Th17）和产IL-17+γδT细胞含量上升，CD4+效应型记忆性T细胞和CD8+效应型记忆性T细胞持续激活，而这些免疫细胞的变化可能是呼吸道共生菌产生保护效应的主要原因。
特定的上呼吸道菌群组合也可以通过预先刺激不同的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）从而促进病原菌的清除。Brown等[17]研究发现，将含有卷曲乳杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌组成的混合物经呼吸道给予小鼠，能够通过诱导产生IL-17A刺激机体分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），激活NOD样受体蛋白-2（NOD-like receptor protein-2，NLRP2），促进对肺部肺炎链球菌和肺炎克雷伯杆菌的清除。普氏菌属是呼吸道共生菌之一。有研究表明，产黑色素普氏菌及其他普氏菌属细菌的脂蛋白可以激活Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2），促进宿主IL-10和中性粒细胞肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌，从而提升对小鼠肺部肺炎链球菌的清除能力；此外，在肺炎链球菌感染时，产黑色素普氏菌也可通过TLR2促进鼠肺中性粒细胞产生组织蛋白酶G和弹性蛋白酶，以促进病原菌的清除[6]。新型冠状病毒感染时，呼吸道菌群结构改变也会影响患者对致病微生物的免疫应答。Lloréns-Rico等[18]通过研究发现，在感染了新型冠状病毒的重症监护病房（ICU）患者中，与无创机械通气组相比，有创机械通气组菌群结构发生明显改变，其中普氏菌属和双歧杆菌等共生菌含量明显下降；研究者进一步使用单细胞测序发现，与呼吸道菌群关联最密切、含量上升最明显的免疫细胞亚型为高表达钙卫蛋白S100A8/A9基因（即骨髓相关蛋白8/9或钙粒蛋白A/B）和S100A12蛋白基因的巨噬细胞及中性粒细胞。钙卫蛋白是由S100A8和S100A9组成的异二聚体，通过与细菌竞争性结合锌、锰和铁等金属离子而发挥抑菌活性。S100A8和S100A9形成二聚体后，与TLR4受体结合，通过促进机体分泌IL-6、TNF-α、活性氧簇和招募炎症细胞等手段杀菌。此外，上述中性粒细胞的脱颗粒蛋白相关叶酸受体-3的基因表达也明显上调，其编码产物可通过竞争性结合叶酸剥夺细菌生长所需的营养成分[18]。
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2.2 呼吸道菌群代谢对宿主免疫的影响：
与肠道菌群类似，呼吸道内的菌群也具有代谢能力。研究表明，放线菌门有产甘油磷脂的潜力，普氏菌属有产鞘脂的潜力[19]。罗斯菌属和链球菌属具有产生甲醇、乙醛和乙醇的潜力，硬质棒状杆菌和龋齿罗氏菌具有产异丙醇的潜力[20，21]。近来的研究也提示，呼吸道菌群既可以通过结构改变来影响宿主免疫，也可以通过调节自身或宿主代谢来调节宿主免疫。Yan等[22]研究发现，在脂多糖和弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中，唾液乳酸杆菌和口乳酸杆菌能够通过在呼吸道产生吲哚-3-醋酸进而改善肺功能，减轻组织损伤，并下调IL-1β、IL-6和IL-17A等炎症因子水平。
短链脂肪酸通常被认为是菌群来源的代谢物。有研究显示，肺内短链脂肪酸水平可能与上呼吸道来源的菌群丰度相关，包括普氏菌属、韦荣球菌属及嗜血杆菌属[21]。同时，这类菌群代谢物可能会通过调控调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）和γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）水平来影响宿主对结核分枝杆菌的易感性[23]。此外，这类菌群代谢物也能够促进宿主固有免疫系统对病原菌的早期清除。拥堵棒状杆菌和无枝菌酸棒状杆菌分泌的脂酶可在体外分解环境中的三酰甘油，产生游离脂肪酸，抑制肺炎链球菌的生长。而在小鼠体内，拥堵棒状杆菌和无枝菌酸棒状杆菌能够在降低TNF-α、IFN-γ、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等炎症因子水平的条件下促进对肺炎链球菌的清除，同时其产生的脂酶也能降低肺炎链球菌的载量[7]。
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3 菌群调节在VAP中的应用
3.1 益生菌/益生元干预：
应用益生菌可以有效抑制VAP的发生发展。国内外大样本前瞻性临床研究显示，给予机械通气患者以乳酸杆菌和双歧杆菌为主的益生菌制剂能明显降低VAP的发生率[24，25]。目前益生菌/益生元疗法在VAP患者中的应用仍存在争议。Li等[26]研究发现，应用肠外营养结合小剂量（少于1×1010 CFU）、多种类的益生菌疗法有助于降低VAP的发生率。同时Tsilika等 [27] 通过研究也发现，经口或鼻饲管给予并发外科创伤的机械通气患者4种混合小剂量益生菌制剂〔嗜酸乳酸杆菌（1.75×109 CFU）、植物乳杆菌（0.5×109 CFU）、乳酸双歧杆菌（1.75×109 CFU）、鲍氏酵母菌（1.5×109 CFU〕后，VAP的发生率明显下降〔11.9%比28.3%；风险比（hazard ratio，HR）＝0.34，95%可信区间（95% confidence interval，95%CI）为0.13~0.92，P＝0.034〕，且脓毒症的发生率也明显下降〔6.8%比24.5%；优势比（odds ratio，OR）＝0.22，95%CI为0.07~0.74，P＝0.016〕。但也有研究者发现，益生菌并不能显著降低VAP的发生率或者改善此类患者的预后。Johnstone等[28]研究发现，在3 d内有机械通气需求的患者中，安慰剂组与接受了1×1010 CFU鼠李糖乳酸杆菌的干预组在VAP发生率方面差异无统计学意义（21.9%比21.3%；HR＝1.03，95%CI为0.87~1.22，P＝0.73）。该研究中80%以上的患者使用过抗菌药物，这可能会降低益生菌的效力，且该研究为多国参与的多中心研究，较大的异质性可能对总体结果有一定影响。由于在多项临床研究中应用的益生菌均为活菌，因此其安全性受到极大的关注。Yelin等[29]研究发现，经口给予危重患者鼠李糖乳酸杆菌可能会导致菌血症的发生，这在一定程度上与危重患者肠道屏障受损有关；同时，研究者在分离出的1株乳杆菌中发现了利福平耐药基因rpoB。总体来说，目前益生菌/益生元疗法在VAP患者中的应用价值仍存在争议。
目前，对于肺部感染而言，益生菌疗法大多是经肠道进行干预。动物研究显示，经鼻腔给予新生鼠懒惰狡诈球菌能短暂升高肺泡巨噬细胞和IFN水平，增强宿主对肺炎链球菌和呼吸道合胞病毒的防御能力；同时，懒惰狡诈球菌也能降低感染时肺泡灌洗液中总蛋白（total protein，TP）和乳酸脱氢酶（LDH）水平[30]。此外，将小鼠下呼吸道来源鼠乳杆菌经鼻腔给予同时感染了链球菌和流感病毒的小鼠后，发现小鼠肺部链球菌载量明显减少[31]。提示经吸入途径调节肺部菌群也可以抵御病原菌的入侵。
3.2 呼吸道共生菌干预：
目前临床尚未开展整体呼吸道共生菌移植，主要以单一或组合菌种干预为主，且人群局限于儿童。Ciprandi等[32]研究表明，将唾液链球菌和口腔链球菌等共生菌经鼻或经口给予上呼吸道感染患儿进行干预，能明显改善上呼吸道感染症状，减少抗菌药物使用次数，降低病情严重程度。而在动物研究中已经进行了上呼吸道共生菌的整体移植。Xiao等[33]使用口咽拭子于健康小鼠牙齿、上颚和舌部取样，将以链球菌属和嗜齿菌属为主的共生菌灌胃给予口腔黏膜炎小鼠进行干预，发现上呼吸道菌群移植能通过激活钙卫蛋白S100A9基因缓解口腔黏膜炎症，降低小鼠血液和组织中IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子水平，提高小鼠存活率。
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4 小结
综上所述，呼吸道菌群及其相关代谢物与宿主免疫系统的联系十分密切，并且在VAP的发生发展中起到了重要的作用，同时共生菌具有激活免疫系统、抑制病原体的能力。目前对宿主-菌群交互关系的深入理解已经催生出粪菌移植等初具成效的治疗手段[34]。与之类似，呼吸道共生菌移植也在预防儿童上呼吸道感染中取得了一定效果[32]。目前，肺部微生态研究的进展主要归功于测序手段的进步和生物信息学的广泛应用，使得对VAP患者菌群改变、转录组和代谢组的研究不断深入。未来这些技术会将呼吸道-菌群交互关系的研究带上新的高度。目前在菌群干预方面发现，无论是通过激活PRR还是调节免疫细胞，个别菌种干预和菌群整体移植均能在一定程度上增强宿主对致病菌的清除能力，并提高宿主存活率，延长存活时间[6，16]。在临床研究方面，目前主流研究大多倾向于使用肠道共生菌干预[35，36]，而呼吸道共生菌干预试验较少，未来可考虑将具有抑制病原体能力的呼吸道普氏菌属和棒状杆菌属细菌纳入临床研究的范畴。此外，为了精准化评估菌群干预带来的影响，研究者也需要探索干预的持续时间和持续范围。结合肺部微生态领域的相关进展，相信未来对VAP发病机制及治疗措施的研究一定能有所突破。
引用: 张博顺, 柒晓玲, 刘嘉琳. 呼吸道菌群在呼吸机相关性肺炎中作用的研究进展 [J] . 中华危重病急救医学, 2023, 35(8) : 889-892.
《药物和医疗器械临床试验300问及案例分析》第2版