复旦大学施奇惠教授：单细胞测序将带来液体活检领域的新机会
2019年5月，由剑桥创新学院（Cambridge Innovation Institute）主办的第七届欧洲分子诊断大会在葡萄牙首都里斯本召开。来自全球各地的400多名与会者在这里一同分享分子诊断领域的最新进展和研究成果。欧洲分子诊断大会是全球最有影响力的分子诊断学大会之一，包括有七个分会、两个短课程、十二个圆桌讨论和大量壁报展示，涵盖了产前分子诊断、免疫疗法生物标志物、液体活检、即时检测等多个热门领域。
本次大会上，复旦大学生物医学研究院的施奇惠教授作为唯一受邀的内地演讲者，发表了主题为“Metabolic Phenotyping and Single-Cell Sequencing of Circulating Tumor Cells in Non-Small Cell Lung Cancer（非小细胞肺癌中循环肿瘤细胞的代谢表型和单细胞测序）”的演讲。
动脉新医药在施奇惠教授回国后第一时间与他取得了联系，并进行了采访。施奇惠教授为我们分享了本次的参会情况以及他对分子诊断领域的见解。
聚焦CTC：用单细胞测序验证准确性很关键
施奇惠教授
CTC（循环肿瘤细胞）一直是施奇惠的主要研究对象之一。本次参会发表的演讲内容也是基于他近期在CTC代谢分型上的研究成果。该项研究成果反映了施奇惠教授团队的最新进展，揭示了CTC在代谢上的异质性，并发现根据不同代谢表型的CTC比例可以预测患者的治疗反应、临床表现和生存率。
施奇惠教授认为，CTC与肿瘤转移的相关性比较强。CTC在肿瘤早筛中的应用重点不应是在早期发现癌症，而是在早期发现已经转移的癌症。
“一般情况下，早期的肿瘤很少会释放CTC到血液当中。但如果肿瘤本身侵袭性很强，那么即使肿瘤本身很小，也可能在很早期就能从血液中检测到CTC。这种情况下用CTC进行早筛是有意义的。”施奇惠说。他认为CTC除了预后、用药指导以外，更重要的应用方向是用于患者分层或者说辅助分期，协助目前的影像学手段区分转移能力强的肿瘤和转移能力弱的肿瘤，从而帮助患者和医生及时发现转移能力强的肿瘤，制定后续的治疗方案。
“CTC主要能从两方面提供信息，一方面是数目，另一方面是分子特征。分子特征包括了基因信息和蛋白信息。CTC数目与肿瘤转移的关系现在还尚不明确，目前主要用于预后，暂时还无法用于判断患者是否已经发生了血行转移，或是已有远端转移。但我们可以确定的是，CTC本身也是具有异质性的，如果能够用特定的分子靶标对CTC进行再分型的话，将来可能将CTC在不同子群中的分布情况与肿瘤患者的转移情况直接联系起来。”施奇惠说。
CTC的临床价值毋庸置疑。Clinicaltrials.gov显示，全球注册的液体活检临床试验中，有关CTC的临床试验一直多于ctDNA。施奇惠告诉我们，CTC领域研究的难点在于CTC相关研究的技术路线纷繁复杂。不同的技术路线可能会捕捉到不同纯度水平的CTC，也可能会捕捉到不同的CTC子群。这就导致了通过不同技术路线获得的CTC数据很难直接进行比较。
CTC的临床试验中广泛使用到的是15年前上市的CellSearch平台。CellSearch平台由强生公司开发，通过EpCAM（上皮细胞黏附分子）富集CTC细胞。这一平台虽然稳定性好，但在一些癌症（如非小细胞肺癌）中灵敏度较低，即使是在晚期肿瘤患者样本中，检出率也并不高。
施奇惠告诉我们，这种灵敏度低可能并不是技术原因造成的。将已知给定数目的肿瘤细胞细胞系混入健康人的血液中再通过该平台检测，肿瘤细胞的回收率很高。他推测检出率低更可能与生物学原因有关。比如有部分CTC经过EMT（上皮间质转化）之后，上皮标志物表达量降低同时细胞变形能力增强。这部分细胞会很难被CellSearch平台检测到。
“在这样的情况下，在CTC研究中使用单细胞测序就显得很有必要了。血液中的CTC数目一定是有研究价值的。但要对其价值进行挖掘，关键的一点是要验证获取到的每一个CTC都的确是肿瘤细胞。这时候就需要对每个被捕获的细胞进行单细胞测序。”施奇惠说。
在施奇惠教授看来，由于单细胞测序的成本和检测复杂程度，这项技术直接应用于临床挑战也不小。单细胞测序已经普遍应用于CTC的基础研究中，比如帮助检验用于分选CTC的生物标志物的准确性，证明用该生物标志物分选出的CTC确实都是肿瘤细胞。当生物标志物经过长期的检测获得了普遍的认可之后，后续在科研和临床上的应用过程就不再需要长期使用单细胞测序的科研方法来验证了。
液体活检接入免疫治疗大有可为
在肿瘤液体活检中，与CTC检测同样重要的就是ctDNA（循环肿瘤DNA）检测。相比之下，ctDNA目前的进展较快，也更贴近临床。施奇惠认为其主要原因是ctDNA的检测对象更清晰（如点突变和甲基化），技术路径也比较直接，实现起来更方便。
不仅如此，ctDNA不像CTC会受到自身异质性的影响，即使使用不同的方法检测到的内容基本也是一致的，结果的可比性较强。
施奇惠说：“目前ctDNA研究有两个热门方向，一是通过TMB（肿瘤突变负荷）来预测免疫治疗疗效，二是癌症的早期筛查。在早筛应用上，ctDNA还有几个难点要克服。比如早期患者的ctDNA浓度过低，很容易受到其他来源的具有突变的cfDNA（游离DNA）的干扰。另外，器官定位也是当前ctDNA早筛应用中的一大难点。”
随着细胞治疗和抗体药物走入临床，免疫治疗在肿瘤治疗领域中的热度迅速蹿升。目前已经在肿瘤组织的相关研究中证明，TMB和PD-L1是预测PD-1/PD-L1免疫抑制剂疗效的独立生物标志物，可以用于为免疫治疗提供伴随诊断。
在组织样本检测中，精准病理可以通过多种方法获取丰富的肿瘤-免疫相互作用的信息。但是由于临床上难以多次进行组织活检，液体活检就有机会在跟踪指导免疫治疗的过程中发挥巨大作用。
据了解，临床上已经能够通过血液中的ctDNA检测bTMB（血液TMB）。施奇惠告诉我们，CTC也可以用于检测肿瘤细胞PD-L1的表达，但是其与原位的一致性还未得到验证。“通过检测患者血液中的新抗原特异性、处于激活状态的CD8+ T细胞，也可以对免疫治疗的效果进行预判。”他说，“这也属于广义上的液体活检。”
胎儿细胞检测（Cell-based NIPT）可能成为NIPT领域的新蓝海
对于国内热门的NIPT（无创产前诊断）领域，施奇惠也有自己的看法。NIPT在国内已经形成了一片初具规模的市场，并带动了一波基因检测行业的风潮。但是施奇惠教授认为，NIPT领域还有更大的发展空间。
“现在NIPT主要检测的是以唐氏综合征为代表的染色体多倍体综合征，但这些在整个染色体畸变、基因突变等所导致的出生缺陷中只占很小一部分。NIPT在出生缺陷筛查上还有很多机会可去挖掘。”他说。
目前NIPT主要检测的是血液中的游离胎儿DNA。施奇惠则认为胎儿细胞在NIPT（cell-based NIPT）中也有很好的发展前景，但实现前提是找到合适的方法来获得尽量多、尽量纯的胎儿细胞。他认为，胎儿细胞包含完整的基因组，因此基于胎儿细胞的检测有潜力为产前诊断提供通用的解决方案。
目前这一方面的研究主要聚焦于血液中的胎儿有核红细胞与滋养层细胞，以及孕妇宫颈粘液中的滋养层细胞。其中血液中的胎儿细胞数目稀少，而宫颈粘液中则有较多的胎儿细胞。
“胎儿细胞现在的发展和CTC的情况很类似，如何有效的鉴别、分离以及测序胎儿细胞是一个比较大的问题，甚至对于胎儿细胞的技术要求更高。因为对于胎儿细胞，单纯计数没有临床意义，必须进行测序。因此，我们不仅要找到合适的鉴别胎儿细胞的生物标志物，还要充分的加以验证。在标志物验证的阶段有必要对每个目标细胞都进行单细胞测序，验证其胎源性。”施奇惠说。
施奇惠告诉我们，在胎儿细胞检测中面临的另一个问题是单细胞测序质量较差，尚不足以形成可靠的诊断。与CTC不同，对胎儿细胞进行计数并没有明确的临床意义，因此测序是胎儿细胞检测不可或缺的组成部分。
但胎儿细胞数目稀少，单细胞测序是目前胎儿细胞检测中的最佳选项。而目前的检测流程较长，包括了细胞的固定染色分离以及单细胞基因组扩增，容易产生基因的偏向性和错误，还需进一步优化。因此目前胎儿细胞单细胞测序仍处在临床前的研究阶段。
随着无创产前诊断与宫内基因编辑技术的进展，未来我们将能够更早的发现出生缺陷并给予治疗。
2020年ISMRC将在上海召开，助力中国液体活检领域与世界接轨
促进国内液体活检领域与国际一流专家、和最新研究的交流，也是施奇惠教授长期关注的重点。由“Liquid Biopsy（液体活检）”概念最早的提出人，德国汉堡大学的Klaus Pantel教授发起，已经召开了20多年的ISMRC会议（International Symposium on Minimal Residual Cancer）是全球液体活检领域历史最长、最有影响力的学术会议。
施奇惠教授、上海胸科医院陆舜教授与Klaus Pantel教授合作，将第12届ISMRC（第一届全球液体活检大会）首次引进中国，计划于2020年10月在上海召开。届时，全球液体活检领域，尤其是CTC、ctDNA和免疫治疗伴随诊断等多个液体活检领域的近百位全球一流专家将汇聚中国，以促进液体活检的发展和转化，助力中国液体活检研究和应用与全球接轨，将更多的中国液体活检成果推向这一世界一流的创新平台。
*封面图片来源：https://www.123rf.com.cn
文 | 郝翰
微信 | hhaaa_bio
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