Nat Commun︱訾佳辰/巫瑞波合作建立高产优质檀香挥发油的细胞工厂

撰文︱张   帆，马兴梅

责编︱王思珍 

制版︱查佳雪

中药药效物质以药效分子群为主要形式，极少为单分子化合物。目前中药药效物质的获取过分依赖植物提取。合成生物学技术可实现天然产物的高效和可持续生产，对于资源稀缺的中药药效物质的获取，具有重要的应用价值。目前天然产物的合成生物学研究主要针对单体化合物。对于药效分子群来说，其组分比例决定了其药效。因此，建立药效分子群的合成生物学方法，必须既提高产量又调控组分比例，这是该研究的难点和瓶颈。

檀香（sandalwood）是名贵中药材，其药用部位是心材、药效物质是挥发油。只有20-30年树龄的印度檀香挥发油能达到优质标准，即药效指标成分a-檀香醇和b-檀香醇的含量分别为41-55%和16-24%[1]。由于过度采伐，印度檀香资源已经濒临枯竭。中国医学科学院药物研究所訾佳辰课题组在前期工作中首次建立了可以生产檀香挥发油所有主要药效分子的细胞工厂，其中a-檀香醇和b-檀香醇的含量分别为36%和18% [2]。通过酶工程手段，改造控制檀香挥发油组分比例的檀香烯合酶，进而建立优质檀香挥发油的生物制备方法，对于解决檀香资源匮乏难题具有重要意义。

2022年5月6日，中国医学科学院药物研究所訾佳辰课题组和中山大学巫瑞波课题组合作在国际学术期刊Nature Communications上发表了题为“Rationally engineering santalene synthase to readjust the component ratio of sandalwood oil”的研究。该研究揭示了催化杂泛性檀香烯合酶（SaSSy）和催化专一性檀香烯合酶（SanSyn）的催化机制，用于指导檀香烯合酶的工程改造，实现了檀香挥发油组分比例优化。

SaSSy能够催化产生多种桥环产物，其中檀香烯(a-santalene和b-santalene) 是由倍半萜1,6-环合途径的中间体A (6S-Bisabolyl cation) 历经环合、烷基迁移和去质子化生成（图1），因此催化过程研究可由中间体A开始进行。作者建立了SaSSy与中间体A复合物模型，并通过QM/MM计算模拟获得了催化反应能量曲线。由中间体A发生环合会历经非经典碳正离子（non-classical carbocation）中间体B，随后历经8.3 kcal/mol能垒发生烷基迁移生成中间体C并明显放热。分子关键态结构发现活性口袋中芳香氨基酸残基F425和F549能够稳定中间体B和C，实验中也发现将二者突变为丙氨酸(Ala)均会导致活性显著下降，印证了二者对催化活性的关键作用。作者发现SaSSy中的T318可能作为广义碱参与到去质子化形成檀香烯产物的过程中，由C态生成a-檀香烯需要克服9.3 kcal/mol的能垒。SaSSy的活性口袋空间相对较大，且中间体B和C态的后续过程均需克服一定能垒，致使二者具有一定的存活时间（lifetime），因此可由B态发生反应提前猝灭产生a-exo-香柠檬烯（exo-a-bergamotene）副产物。而对于C态，随着反应过程形成桥环中间体，口袋中的未占据空间（unoccupied space）进一步增大，使中间体C具有更多的构象变化空间（表现为相对较大的C6–C7–C8–C9二面角波动范围），因此可在T318作用下从C4和C13两个位置去质子化，分别生成a-檀香烯（a-santalene）和b-檀香烯（b-santalene）（图1）。实验对T318A的突变体表达发现其几乎丧失檀香烯产物的生成能力，从而验证了T318对产物生成的重要作用。

图1 SaSSy催化反应过程的计算模拟

（图源：Zha WL, et al., Nat Commun, 2022）

与SaSSy相比，SanSyn主要生成a-檀香烯（较高的催化专一性），其活性口袋空间相对较小，中间体A构象与SaSSy中不同，反应过程中间体构象受到严格限制，从而使从中间体A历经中间体C再到a-檀香烯的反应路径成为优势反应路径（图2）。SanSyn中T298与SaSSy可能参与去质子化过程的T318位于同一位点，因此推测在SanSyn中T298可能参与到去质子化生成檀香烯产物的过程中。QM/MM计算发现SanSyn中对应的中间体B与C存活时间相对SaSSy中较短（表现为更低的后续反应能垒），并且中间体B采取更为紧缩构象的很容易进一步发生烷基迁移转化为中间体C。根据上述结果，作者认为SaSSy与SanSyn相比较最大的不同是：后者活性口袋中未占据空间比较局限，反应中间体的构象动力学受到限制，这也是其表现出催化专一性的关键因素。而将活性口袋中能够影响中间体构象且具有较大侧链体积的残基替换为体积较小残基，可以释放活性口袋空间，从而可能改变反应中间体的构象动力学性质，形成SaSSy中类似的多产物途径。

基于这一点，作者进一步对比了SaSSy和SanSyn反应过程关键态结构，发现SanSyn中的F441限制了中间体C的构象（表现为相对较小的C6–C7–C8–C9二面角波动），因此T298仅能从C4位去质子化生成a-檀香烯（图2）。F441位点也是SanSyn与SaSSy活性口袋中（SaSSy对应位点为S459）的显著差异位点，因此选取该位点进行饱和突变实验。结果显示：SanSyn F441V突变体中产物比例发生变化，b-檀香烯生成获得提升，且产物分布占比达到预期目标。进一步对F441V突变体进行建模和QM/MM计算发现：F441V突变能显著增加活性口袋的空间，从而增加中间体C构象变化空间，使T298能够从C4和C13位置去质子化，同时生成a-檀香烯和b-檀香烯。

图2 比较SaSSy, SanSyn和SanSyn^F441V的活性口袋

（图源：Zha WL, et al., Nat Commun, 2022）

然后，采用SanSyn^F441V构建檀香烯/檀香醇的细胞工厂。通过优化甲羟戊酸途径，促进前体化合物二甲基烯丙基焦磷酸和异戊烯基焦磷酸的合成；通过抑制酵母角鲨烯合酶（ERG9）以及敲除酵母二酰基焦磷酸磷酸酶（DPP1）和脂质磷酸磷酸酶（LPP1），降低其它通路对法尼烯基焦磷酸（FPP）的消耗。由于前期所建立的工程菌以价格比较昂贵的半乳糖作为碳源，本研究优化了从乙醇到乙酰辅酶A的生物转化途径，使得可以采用价格低廉的乙醇作为工程菌发酵的碳源，大大降低了发酵成本。研究中，作者发现酵母中的两种老黄酶（OYE2和OYE3）和两种酰基转移酶（ATF1和ATF2）可以把a-檀香醇依次转化为二氢-a-檀香醇和乙酰二氢-a-檀香醇，运用CRISPR-Cas9敲除这四种酵母内源酶，进一步提高了a-檀香醇的产量。最后，采用同源重组删除酵母的转录抑制因子ROX1（图3）。以上代谢工程优化将檀香挥发油的产量提高至704.2 mg/L，并且a-檀香醇、b-檀香醇和a-exo-香柠檬醇的含量分别为43.4%、22%和6.7%，与印度檀香挥发油一致，达到国际标准（ISO 3518:2002）。

图3 代谢工程优化策略

（图源：Zha WL, et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究利用QM/MM多尺度模拟首次获得了催化杂范性和专一性的檀香烯合酶（SaSSy和SanSyn）的催化反应能量曲线，鉴定了参与碳正离子中间体脱质子的关键氨基酸；同时发现SanSyn中的F441限制了中间体C的构象，尤其限制了C6–C7–C8–C9二面角波动，所以仅在C4位发生脱质子，生成a-檀香烯；SanSyn^F441V突变体的活性口袋空间显著增加，C6–C7–C8–C9二面角波动变大，因此C4和C13位均能发生脱质子，生成a-檀香烯和b-檀香烯。运用SanSyn^F441V构建的细胞工厂所产生的檀香挥发油完全达到国际标准。以上结果表明QM/MM多尺度模拟是揭示酶催化机制的有效手段，基于机制解析挖掘关键残基的功能可以助力酶催化活性的理性设计改造；而联合酶工程和代谢工程的策略，为建立中药药效分子群、植物药药效成分等高价值天然成分群的异源生物合成体系开拓了具有普适性的研究思路。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-30294-8

暨南大学博士研究生查文龙、中山大学博士后张帆博士为论文共同第一作者，中国医学科学院药物研究所訾佳辰研究员、中山大学巫瑞波教授为论文共同通讯作者。该研究获得中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2021-RC350-009）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2021-I2M-1-029）及国家自然科学基金（21773313）等项目的支持。

通讯作者：訾佳辰（左）；巫瑞波（右）

（照片提供自：訾佳辰及巫瑞波课题组）

通讯作者简介：

巫瑞波，中山大学 教授，博士生导师，课题组网页地址：http://www.qmclab.com。课题组主要研究方向为萜类多尺度模拟，借助量子-经典力学模拟、大数据挖掘和深度学习等策略，开发数据库和算法，解析酶催化与生物合成途径等分子机制,并与实验合作开展蛋白活性改造和抑制剂设计。

訾佳辰，中国医学科学院药物研究所 研究员，博士生导师，课题组网页地址：https://www.imm.ac.cn/kydw/yjyzzkyg/76038f94ab4c443fa2b652f3c5ab9dbd.htm。课题组主要从事植物源药效成分的异源生物合成研究。揭示药效分子的生物合成途径，阐明关键酶的催化机制，在此基础上，联合酶工程和代谢工程，实现目标分子的高效生物制备。课题组长期招聘天然产物、植物生物学等相关背景的研究助理和博士后，具有植物遗传学和生物信息学背景者优先。

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参考文献

1. Sciarrone D, Costa R, Ragonese C, Tranchida P Q, Tedone L, Santi L, Dugo P, Dugo G, Mondello L. Application of a multidimensional gas chromatography system with simultaneous mass spectrometric and flame ionization detection to the analysis of sandalwood oil. Journal of Chromatography A, 2011, 1218: 137−142.

2.  Zha W L, An T Y, Li T, Zhu J X, Gao K, Sun Z J, Xu W D, Lin P C, Zi J C*. Reconstruction of the biosynthetic pathway of santalols under control of the GAL regulatory system in yeast. ACS Synthetic Biology, 2020, 9(2): 449–456.

本文完