Sci Adv | 盛能印/毛炳宇/丁玉强团队合作发现AMPA受体泛素化在兴奋性突触功能调控中的新机制

撰文︱盛能印，马鹏程

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

人类大脑中约含有100亿个神经元，它们通过突触结构彼此连接构成神经网络进行信息交流整合，是执行大脑各种生理功能的物质基础。其功能调控紊乱是神经精神疾病发生的重要原因之一，也是相关疾病干预治疗的重要靶点。谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经递质，其所对应的谷氨酸受体在神经元突触部位的表达水平，是突触信息传递的效率以及神经网络活性的重要决定因素。

AMPA型谷氨酸受体在突触后膜中的表达定位和功能调控决定了兴奋性突触传递活性的强度，这一过程是神经元活性依赖的。神经元内AMPA受体的转运调控过程决定了其在突触后膜的动态变化，也是突触可塑性（长时程增强LTP和长时程抑制LTD）产生的关键前提[1]。AMPA受体是由不同的GluA1/2/3/4亚基组合构成的四聚体复合物，已知这些亚基的多种蛋白质翻译后修饰（磷酸化、糖基化和棕榈酰化），参与调控突触后膜AMPA受体的动态转运过程[2]。虽然泛素化-蛋白酶体系统介导的蛋白质稳定性调控在突触传递和可塑性中发挥重要作用[3]，但对AMPA受体泛素化调节的分子机制，以及如何影响兴奋性突触传递活性仍知之甚少。目前已经明确的AMPA受体E3泛素连接酶有Nedd4、Nedd4L、APC^Cdh1和RNF167，它们也参与兴奋性突触传递活性调控[4, 5]，且其介导AMPA受体蛋白稳定性调控紊乱也可能与相关神经疾病发生发展密切相关，如与癫痫相关的Nedd4L基因点突变会影响GluA1受体的泛素化从而导致神经元过度兴奋[5]。然而，关于AMPA受体泛素化调控在兴奋性突触功能调控中的作用及分子机制，以及这种分子调控与神经疾病之间存在怎样的内在联系，仍有待于进一步深入研究。

该团队长期关注E3泛素连接酶RNF220在中枢神经系统发育过程中的作用机制，近几年系统研究工作发现，其在神经细胞命运决定和神经管模式化等发育过程中发挥重要作用[6-11]。近期一项疾病遗传研究报道RNF220纯合突变（R363Q和R365Q）会导致大脑功能异常，并且多种临床症状与突触调控功能紊乱密切相关，如智力障碍和癫痫[12]。虽然我们前期研究结果也表明该基因也在小鼠成年皮层和海马中高表达，但对于RNF220在成熟神经元中的泛素化底物和生物学功能仍一无所知，特别是该分子调控是否参与突触调控及大脑生理功能和病理过程。

2022年9月30日，中国科学院昆明动物研究所盛能印研究员、毛炳宇研究员与复旦大学的丁玉强教授课题组通力合作在Science Advances上在线发表了题为“RNF220 is an E3 ubiquitin ligase for AMPA receptors to regulate synaptic transmission”的文章，回答了上述科学问题。该研究揭示了RNF220作为AMPA受体新型泛素化连接酶，在突触传递活性调控中的功能和分子机制。

为了解析RNF220在成熟神经元中的功能机制，针对其在成年大脑中主要表达于皮层和海马这一特性，研究人员将RNF220^fl/fl条件性敲除小鼠与Emx1-Cre工具鼠杂交，实现在前脑区域特异性敲除RNF220分子，发现：

（1）在此小鼠模型中，大脑皮层和海马的发育和形态结构未见异常；但电生理实验分析发现AMPA受体介导的微小兴奋性突触电流（mEPSC）的振幅和频率，及刺激性兴奋性突触电流（eEPSC）均显著性增强，而长时程增强LTP能力显著减弱。同时，生化实验分析结果表明神经突触后致密体（PSD）中AMPA受体的表达水平显著上升，而NMDAR以及其他兴奋性突触关键蛋白的表达没有明显变化（图1A-C）。这一发现表明，E3连接酶RNF220参与调控兴奋性突触传递和突触可塑性，并提示可能是通过调节AMPA受体的蛋白稳定性以发挥作用的。

图1. 泛素连接酶RNF200促进AMPA受体泛素化修饰并调控其膜定位水平，参与AMPA受体介导的兴奋性突触传递和可塑性。（图源：Ma et al., Sci Adv, 2022）

（2）为验证这一假设，研究人员进一步结合体外细胞和培养海马脑片及体内小鼠模型，发现GluA1和GluA2受体是RNF220泛素连接酶的直接底物，且RNF220酶活突变体或RING结构域缺失结构过表达不影响AMPA受体介导的eEPSC，说明RNF220对AMPA受体介导的eEPSC的增强依赖于其泛素化连接酶活性；而通过对AMPA受体点突变的泛素化分析，研究人员发现GluA1胞内端结构域中的K823和K868以及GluA2胞内端结构域中的K825、K848和K864位点是被RNF220介导泛素化的位点。进一步的分析表明，当将GluA1和GluA2受体胞内端潜在的RNF220泛素化位点突变后，RNF220也不能调控这两种受体在兴奋性突触后膜的表达定位（图1D）。此外，RNF220对于AMPA受体的蛋白稳定性调控机制，也参与AMPA受体在神经元细胞膜的转运表达过程。

（3）针对上述小鼠模型进行学习和记忆相关的神经行为学分析，发现RNF220分子在前脑缺失后，会显著降低小鼠的短期记忆能力，如恐惧记忆、新物体识别和社交记忆，而其长期记忆水平，如水迷宫和恐惧记忆，则没有明显变化（图1E）。

（4）分子生化分析发现，疾病遗传发现的两种RNF220致病突变R363Q和R365Q会显著减弱RNF220与AMPA受体的相互作用，以及对后者的泛素化调节过程；同时，电生理结果也证实这两种致病突变使得RNF220丧失了调控兴奋性突触传递活性的能力；以及免疫荧光实验结果也证明RNF220的两个致病突变并不能挽救其缺失导致的AMPA受体在神经元膜定位的升高（图1F）。

图2. 工作总结图：RNF200作为新型AMPA受体泛素化链接酶调控突触活性和神经行为

（图源：盛能印/毛炳宇/丁玉强团队）

中国科学院昆明动物研究所马鹏程副研究员、在读博士生万梨和李雨薇，同济大学博士生贺春辉为论文的共同第一作者；中国科学院昆明动物研究所盛能印研究员和毛炳宇研究员、复旦大学丁玉强教授为论文的共同通讯作者。该研究得到来自国家自然科学基金委、中国科学院以及云南省科技厅等项目的资助。

文章结论与讨论，启发与展望综上，该研究发现RNF220是一种新的AMPA受体的E3泛素连接酶，阐明了其在兴奋性突触传递和可塑性调控及学习记忆功能中的作用机制，提出RNF220基因突变导致人智力障碍等神经系统相关疾病的潜在机理，丰富了人们对突触蛋白稳定调控在大脑生理功能和相关病理进程中的认识，为相关疾病的诊疗提供了重要理论依据（图2）。在本研究中，我们重点关注了RNF220对突触相关蛋白稳定性的调控，无法排除RNF220对其他靶蛋白的调控也参与了该生理过程。另外，RNF220是否在大脑其他类型神经细胞中发挥重要功能有待进一步的研究和确认；同时，未来对携带RNF220基因致病突变的基因敲入小鼠的分析将有助于进一步全面理解RNF220突变导致的神经系统相关疾病的机理，为相关疾病的诊疗提供动物模型的支撑。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abq4736往期文章精选优质科研培训课程推荐【1】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会（10月29-30日 腾讯在线会议）【2】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（2022年10月15-16日 腾讯会议）【3】临床预测模型构建与论文撰写：从入门到精通实战训练营（2022年10月4-7日，腾讯会议）欢迎加入“岚翰生命科学” ”岚翰生命科学“ 诚聘副主编/编辑/运营岗位 (在线办公)
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本文完