Cancer Sci｜范昌发/王佑春/谢良志团队报道hKDR人源化小鼠模型及抗血管生成药效评价

撰文︱曹   愿，孙春昀，霍桂桃，范昌发

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

恶性肿瘤是影响人类健康的主要威胁之一，其发病率逐年上升。1971年，Folkman首次提出血管生成是实体瘤生长和增殖的必要过程，由此人们意识到抗肿瘤血管生成可能是一种潜在的治疗肿瘤的策略[1]。血管生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与肿瘤血管的早期生成，在肿瘤的发生、发展过程中持续表达[2]。因此，针对VEGF/VEGFR（VEGF受体）的血管生成抑制剂被越来越多地用于抗肿瘤的临床研究。目前，经FDA批准上市的药物如索拉非尼（sorafenib）, 舒尼替尼（sunitinib）, 阿西替尼（axitinib）, 帕唑帕尼（pazopanib）等均作用于VEGF靶点。贝伐单抗（bevacizumab，商品名：Avastin）是重组人类单克隆IgG1抗体，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的抗体类药物，用于一线治疗转移性结直肠癌。针对VEGFR2（KDR）靶点的抗体药物如雷莫芦单抗（ramucirumab，商品名：Cyramza）是一种全人源、靶向VEGFR2的IgG1型单克隆抗体，是目前唯一一个上市的靶向VEGFR2的抗体药物。

人-鼠VEGFR的基因序列存在差异，其同源性仅为85%，由于二者性质不同，不能相互替代，普通野生型小鼠不是评价VEGF/VEGFR靶点抗体或者抑制剂类药物最佳动物模型。为此，作者建立了VEGFR人源化的小鼠模型，命名为C57BL/6-Kdr^em1(hKDR)/NIFDC（简称hKDR小鼠）。该模型于2020年12月29日申请国家专利，目前已经获得专利授权（ZL202011594798.9）。本研究联合神州细胞工程有限公司，采用自主研发的VEGFR2-HK19、上市抗体ramucirumab及鼠源抗体DC101等多个抗体进行联合验证，结果表明模型性能稳定，实验结果符合预期。

近日，中国食品药品检定研究院范昌发研究员/王佑春研究员团队、神州细胞工程有限公司谢良志研究员团队合作在Cancer Science上发表了题为“Novel hKDR mouse model depicts the antiangiogenesis and apoptosis-promoting effects of neutralizing antibodies targeting vascular endothelial growth factor receptor 2”的研究论文。该研究工作呈现了一种新型hKDR人源化小鼠，并评价了针对VEGFR2靶点的抗体的体内效力，阐述了抗VEGFR靶点抗体抗肿瘤机制。该工作填补了未来开发抗血管生成治疗药物的动物模型和体内评估药效策略的空白，具有重要意义。（拓展阅读：范昌发/王佑春团队最新研究进展，详见“岚翰模式科学”报道（点击阅读）：STTT 综述︱王佑春/范昌发团队系统总结新冠COVID-19动物模型研究进展、不足及未来的模型研究趋势）

本模型采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将人源KDR基因的蛋白质编码区（coding sequence, CDS）的部分外显子4至外显子7插入到小鼠Kdr基因的外显子4处构建打靶载体（图1A），采用张峰实验室网站（https://zlab.bio/guide-design-resources）提供的方法设计sgRNA（GTTTGAAATCGACCCTCGGCAGG）。经过体外转录、纯化等操作后，将打靶载体、sgRNA和Cas9 mRNA共同注射入C57BL/6小鼠囊胚，移植待产。

为获得首建鼠尾，出生小鼠的鼠尾基因组DNA经PCR方法筛选，从出生的93只小鼠中筛选出2只基因阳性小鼠。继续繁殖至F1代，对后代出生小鼠进一步鉴定，包括采用PCR、DNA测序和Southern blotting等方法。结果表明，首建鼠成功插入人源的hKDR基因（图1B-D）。在mRNA水平上，hKDR小鼠的人源VEGFR的mRNA在心、肺和肾脏组织中均有表达，而在野生型小鼠中无表达；纯合子hKDR小鼠中未检测到鼠源mKDR的mRNA表达（图1E, F），表明小鼠体内mKDR完全被hKDR取代。

图1 利用CRISPR/Cas9技术构建hKDR人源化小鼠模型

（图源：Cao Y, et al., Cancer Sci, 2022）

雷莫芦单抗（IMC-1121B）是一种全人源的，靶向VEGFR2的单克隆抗体，能够以高亲和力靶向VEGFR2的胞外区，阻止VEGFR2和所有VEGF配体形成二聚体，从而阻断VEGF和VEGFR2介导的信号转导和血管生成。临床前研究证实了Ramucirumab具有确切的疗效和安全性[3]。DC101是鼠源的，靶向鼠VEGFR2的抗体。为了进一步验证本模型，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法对Ramucirumab和新研发的VEGFR2-HK19抗体的结合表位进行对比研究，发现V135I、L313R、I256L位点是人与小鼠之间VEGFR2的不同配体结合区域。这些位点也是影响人-鼠VEGFR功能不同的关键位点。进一步研究发现， Ramucirumab和VEGFR2-HK19不能与鼠的VEGFR2交叉结合，只保留了与猴的VEGFR2的结合能力（图2），说明hKDR人源化小鼠模型插入的hKDR序列能够准确识别人源化抗体并与之结合，进一步验证了该模型。

图2 表位定位及Ramucirumab与小鼠VEGFR2结合能力

（图源：Cao Y, et al., Cancer Sci, 2022）

为了研究hKDR人源化小鼠是否能作为VEGFR靶向药物的体内评价模型，对3周龄的hKDR小鼠和野生型小鼠（wild-type, WT）同时接种MC38肿瘤细胞，数量为5×10⁶个/只小鼠，采用长×宽×宽/2公式计算肿瘤。待肿瘤长至100-200mm³时，对荷瘤小鼠随机分组（n=8），分别给予PBS、Ramucirumab及VEGFR-HK19（20 mg/kg i.v.），一周两次，连续给药6次，每次给药前对小鼠肿瘤及体重进行监测，末次给药后处死小鼠并剥取肿瘤组织（图3A），结果发现，给予Ramucirumab、VEGFR-HK19的hKDR小鼠肿瘤组织体积及重量均显著低于其他各组（图3B-D），体重变化与肿瘤增长趋势一致（图3E）。这些数据表明，hKDR小鼠适合作为评价人源化抗体的体内实验动物模型，VEGFR-HK19单克隆抗体有良好的抗肿瘤活性。

图3 Ramucirumab选择性地抑制hKDR小鼠肿瘤生长

（图源：Cao Y, et al., Cancer Sci, 2022）

图4 人源化VEGFR2抗体抑制hKDR小鼠肿瘤生长

（图源：Cao Y, et al., Cancer Sci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了hKDR人源化小鼠，发现V135I、L313R、I266L位点是人与小鼠之间VEGFR2的不同配体结合区域。DC101能够靶向小鼠VEGFR2，与人VEGFR2无交叉反应。Ramucirumab是一种人源化IgG1单克隆抗体，分别在hKDR和WT移植瘤小鼠中进行评估，结果显示，hKDR小鼠的肿瘤体积明显减小，而WT小鼠的肿瘤体积没有减小，表明只有人源化hKDR小鼠能复制Ramucirumab的体内效力。VEGFR2-HK19是一种新的人源化单克隆抗体，与Ramucirumab类似，在hKDR小鼠模型中选择性抑制肿瘤生长，但在WT小鼠中无抑制作用，表明VEGFR2-HK19具有抗肿瘤活性（图4）。本研究呈现了经过充分验证的人源化hKDR小鼠模型，以及针对VEGFR靶点的体内效力评价方法，填补了未来开发抗血管生成治疗药物的动物模型和体内评估方法的空白，有望适用于评估临床候选药物。此外，Yoh等人报道，Ramucirumab在临床中联合多西紫杉醇可延长肺小细胞癌患者的生存期[4]，因此，多靶点药物的联合用药可能成为未来治疗肿瘤的新趋势。下一步，作者将进一步探索hKDR小鼠模型作为评价模型的潜力。
原文链接：DOI: 10.1111/cas.15594.

中国食品药品检定研究院曹愿、霍桂桃，神州细胞工程工程有限公司孙春昀为本文的共同第一作者，谢良志、王佑春、范昌发研究员为本文共同通讯作者。本工作获得国家科技重大专项（2018ZX0901001-004-002）的支持。

第一作者：曹愿（左），通讯作者：王佑春（中）、范昌发（右）

（照片提供自：中国食品药品检定研究院王佑春/范昌发研究员团队）

作者简介（上下滑动阅读） 

曹愿，女，硕士学历，毕业于北京中医药大学，现工作于中国食品药品检定研究院，从事模式动物的研究制备。2018年承担国家科技重大专项“用于抗体成药性评价的人源化嵌合小鼠模型的构建及应用”课题（2018ZX0901001-004-002），发表中英文论文7篇，申请5项专利，授权2项。

谢良志，中国医学科学院协和医科大学细胞工程中心教授，主任，北京神州细胞生物技术股份公司董事长，总经理。本科和硕士毕业于大连理工大学，1991年出国留学，1996年获美国麻省理工学院博士学位，曾在美国默克公司担任高级工程师、研究员，从事基因工程疫苗研发工作。2002年回国创立神州细胞工程有限公司，2007年创办北京义翘神州科技股份公司。自90年代初开始一直从事单克隆抗体药物、病毒疫苗等生物制品的研发工作。参与我国多次新发突发重大传染病应急药物的研发和技术攻关。

王佑春，中国食品药品检定研究院疫苗检定首席专家，于原北京医科大学获流行病学专业医学博士学位，于英国伦敦大学学院（UCL）获病毒学专业哲学博士学位。长期从事医学病毒学的流行病学、分子生物学以及相关产品的质量控制方法研究。近年来，主要集中于新突发病毒性传染病的病原研究以及相关制品评价方法的研究。

以第一或通讯作者发表论文310余篇，其中发表在Cell (3篇), Science（1篇), Nature (3篇), Cell Research, STTT, Cell Discovery, Cell Host & Microbes, J Hepatol, Nature Microbiology, National Science Review, Nature Communication, EMI, Nature Protocols等SCI杂志上100余篇。以第一完成人获：国家科技进步二等奖1项；中华医学科技一等奖、北京市科学技术一等奖和中华预防医学会一等奖各1项。获共青团中央第五届中国优秀青年科技创新奖，第二届以岭生物医药创新奖，第十八届吴杨药学奖,中国药学发展奖食品药品质量检测技术奖特别贡献奖，全国科技系统抗击新冠肺炎疫情先进个人。中华医学会病毒学专业委员会前任主任委员，现为WHO生物制品标准化委员会委员，中华医学会微生物和免疫学委员会副主任委员，药典委员会疫苗专业委员会主任委员。

范昌发，男，博士学历，研究员，博士研究生导师，模式动物研究室主任。从头组建中检院“遗传修饰动物模型制作平台”，构建人源化新冠小鼠模型hACE2-KI，自主建立致癌性模型KI.C57-ras V2.0等代表性小鼠模型。发表论文近100篇，包括Science (2篇)、Nature、CellHost & Microbe、STTT (3篇)、National Science Review、EMI (3篇)等杂志；申请专利12项，授权8项；承担或组织申请国自然基金、国重大新药创制专项、国传染病重大专项、国病原学专项课题等17项；中国药学会科学技术奖二等奖1项、北京市科学技术进步奖二等奖1项，北京市科学技术进步奖一等奖1项。自主研制遗传修饰大、小鼠模型50余种。研究工作被英国The Economist、美国Cell Press、中国科学网、北京科技报等媒体专题报道。

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参考文献（上下滑动阅读） 

1. Folkman, J. (1971) Tumor angiogenesis: therapeutic implications. New England Journal of Medicine. 285(21), 1182.

2. Bergers, G., et al. (2003) Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nature Reviews Cancer. 3(6), 401–410.

3. Spratlin, J.L., et al. (2010) Phase I pharmacologic and biologic study of ramucirumab (IMC-1121B), a fully human immunoglobulin G1 monoclonal antibody targeting the vascular endothelial growth factor receptor-2. Journal of Clinical Oncology. 28, 780-787.

4. Yoh, K., et al. (2016) A randomized, double-blind, phase II study of ramucirumab plus docetaxel vs placebo plus docetaxel in Japanese patients with stage IV non-small cell lung cancer after disease progression on platinum-based therapy. Lung Cancer. 99, 186-193.

本文完