Protein Science︱方雷/吴喜林团队合作构建高亲和力的抗Gn单克隆纳米抗体

撰文︱李欣谕责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇
严重发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由新型布尼亚病毒（SFTSV）引起的急性传染病[1]，死亡率为6.3%~30%，至今为止尚无针对SFTS的特定治疗方法[2]。有研究表明，抗SFTSV表面糖蛋白（糖蛋白N，Gn）的中和抗体与患者生存高度相关，血清中无抗Gn抗体的SFTS患者死亡率高达66.7%，抗Gn的中和抗体可能发挥保护作用。纳米抗体（Nanobody）也称为单域抗体，通常在骆驼科动物中天然产生，和传统抗体相比具有分子量小、便于改造、理化性质稳定等优点[3]。因此，建立高通量筛选和生产高亲和力Gn单克隆纳米抗体的技术路线，可以为SFTS的治疗提供新思路。
近日，南京大学医学院方雷课题组和吴喜林课题组合作在Protein Science上发表了题为“Development of functional anti-Gn nanobodies specific for SFTSV based on next generation sequencing and proteomics”的研究。这项工作高效整合了二代测序（NGS）和亲和纯化-蛋白质谱检测（AP-MS）等技术手段，以高通量筛选来自用Gn蛋白免疫的骆驼的高亲和力单克隆抗Gn纳米抗体，并对其中的纳米抗体57493对Gn的特异性和功能进行了验证，为SFTS的治疗方法提供启示。同时，该开发过程建立的技术路线也可以扩展到针对SARS-CoV-2等其他病毒的特异性纳米抗体的生产。
首先，采用Gn蛋白免疫骆驼，第四次免疫后的抗血清滴度可达4.61×10⁶，能够特异性识别转染SFTSV不同亚型质粒的293F细胞，具有广泛的免疫性。接下来在骆驼血清中筛选抗原特异性抗体，使用Protein G和Protein A树脂柱从血清中分离出总IgG，使用不同pH梯度浓度的磷酸盐缓冲液进行洗脱，继续分离不同亲和力的多克隆抗体；对不同洗脱组分进行检测，最后使用IgG2和IgG3组分进行后续的质谱检测（图1）。

图1 骆驼免疫、抗Gn纳米抗体的亲和纯化以及纳米抗体参考蛋白质数据库建立

（图源：Wang BH, et al., Protein Science, 2022）

为了分析得到的LC-MS/MS原始数据，需要一个定制的纳米抗体参考蛋白质数据库。为此，作者对免疫后骆驼的B细胞进行了转录组测序，共获得6.5Gb的Clean Data，其中测序质量在Q30以上的转录本百分比为92.83%。在此基础上，作者证明了转录组测序结果质量的可靠性，并完成了基于Unigene库的CDS预测，以此建立的纳米抗体参考蛋白库为后续的质谱检测和分析提供了基础（图1）。

选用谷氨酸C端内切酶GluC、赖氨酸C端内切酶LysC、赖氨酸N端内切酶LysN、胰蛋白酶Trypsin和胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin分别酶解抗Gn多克隆纳米抗体，将酶解得到的肽段混合物进行质谱检测。针对纳米抗体参考蛋白质数据库搜库后对数据进行质控处理，总共鉴定得到56条不同的蛋白序列。为了明确鉴定到的蛋白序列是否纳米抗体，作者使用BLAST+(2.90)和V-QUEST对这些蛋白序列和已知纳米抗体的保守框架进行了对比分析，总共有32条蛋白序列比对成功，并基本确定了这些纳米抗体序列的CDR区（图2）。

图2 高亲和力抗Gn纳米抗体经多酶酶切后的蛋白质谱分析

（图源：Wang BH, et al., Protein Science, 2022）

在此基础上，作者进一步筛选出6条单克隆抗Gn纳米抗体的蛋白序列，它们在Unigene库中对应的编号分别为2053、7781、57493、13713、70251、68352（图3）。

图3 筛选出的6条单克隆抗Gn纳米抗体的CDR区序列及其对应肽段的二级谱图（MS/MS）

（图源：Wang BH, et al., Protein Science, 2022）

进一步，将筛选得到的6条单克隆纳米抗体的cDNA序列分别构建基因工程表达载体，瞬时转染293F细胞进行无血清表达以后，利用ELISA检测它们对于Gn蛋白的抗原亲和性，发现纳米抗体57493显著高于其它抗体，并被成功纯化出来（图4）。无论抗原Gn在还原或非还原状态下，单克隆纳米抗体57493作为一抗得到的Western Blot 条带都与对照组（兔抗Gn一抗）获得的条带一致，表明纳米抗体57493可特异性识别并结合抗原Gn，提示其具有正常的生物学功能。同时，也证明了本研究技术路线在高通量筛选和生产高亲和力抗Gn单克隆纳米抗体的可行性和有效性（图5）。

图4 单克隆抗Gn纳米抗体的基因工程表达载体以及PAGE检测

（图源：Wang BH, et al.,Protein Science, 2022）

图5 纳米抗体功能验证

（图源：Wang BH, et al., Protein Science, 2022）

图6 基于二代测序和亲和纯化-质谱生产单克隆抗Gn纳米抗体的整体工作路线

（图源：Wang BH, et al., Protein Science, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望相比于传统抗体需要解决复杂的重链轻链配对的问题，纳米抗体由于只含有重链，更加适合利用二代测序和蛋白质组学结合的策略进行高通量的鉴定和生产（图6）。在这项工作中，作者将二代测序技术和亲和纯化-质谱技术进行了高效的整合，以高通量筛选和鉴定来自用Gn蛋白免疫的骆驼的单克隆抗Gn纳米抗体。从鉴定到的单克隆纳米抗体序列中筛选出6条序列用于重组蛋白的基因工程表达，并纯化和生产获得了一种对Gn蛋白具有高度特异性和亲和力的纳米抗体57493，相关技术路线如图6所示。同时，作者也指出高质量的纳米抗体参考蛋白质数据库是此类研究能否成功的关键，而该研究中采用的参考蛋白质数据库尚不完善。在未来的研究中，可通过多个策略继续优化参考蛋白质数据库，如通过进行多轮的转录组测序并整合所有测序结果，构建更全面、更准确的参考蛋白质数据库。另一方面，可以进一步优化多酶酶切策略，使用更多类型的蛋白酶覆盖更广泛的切割位点。这些蛋白酶覆盖的切割位点越多，纳米抗体CDR区域的覆盖率就越高，可帮助更多新颖性的纳米抗体通过数据库搜索完成筛选和鉴定。

总之，这项工作不但为SFTS的治疗提供了新思路，开发的创新性高通量技术路线也可以进一步优化并扩展到针对SARS-CoV-2等其他病毒的特异性纳米抗体的生产，具有广阔的应用前景（图6）。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pro.4461
南京大学医学院硕士生王炳昊和博士生黄碧莲为该论文的共同第一作者，方雷教授、吴喜林副研究员和博士后章竞子为论文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金面上项目、江苏省自然科学基金面上项目、南京大学技术创新基金和南京大学化学与生物医药创新研究院（ChemBIC）的支持。

方雷教授课题组全家福

（照片提供自：方雷实验室）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

方雷，南京大学医学院教授、博士生导师。在南京大学获得博士学位，随后进入美国加州大学Irvine分校和纽约大学Langone医学中心继续博士后和助理研究员研究。回国工作以来，在南京大学医学院从头搭建了稳定高效的蛋白质组学和大数据平台，并逐步建立了多种疾病蛋白质组学研究的技术手段和方法，广泛开展基于“蛋白质组学驱动的精准医学”以及“代谢稳态调控与疾病发生”的研究。作为主要完成人获得了国家技术发明二等奖(排名第四)和江苏省科学技术一等奖(排名第三)。目前在Nature Communications，Signal Transduction and Targeted Therapy，EMBO Journal，Redox Biology以及蛋白质组学顶尖期刊Mol Cell Proteomics和J Proteome Res.共发表SCI论文60余篇。近五年来主持国家自然科学基金面上项目两项和青年基金项目一项，主持江苏省自然科学基金面上项目两项。

往期文章精选优质科研培训课程推荐【1】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会（10月29-30日 腾讯在线会议）【2】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（2022年10月15-16日 腾讯会议）【3】宏基因组与代谢组/脂质组学R软件数据可视化研讨会（10月29日 腾讯在线会议）欢迎加入“岚翰生命科学” ”岚翰生命科学“ 诚聘副主编/编辑/运营岗位 (在线办公)
参考文献（上下滑动阅读） 

[1] YU X-J, LIANG M-F, ZHANG S-Y, et al. Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China [J]. N Engl J Med, 2011, 364(16): 1523-32.

[2] GUO C T, LU Q B, DING S J, et al. Epidemiological and clinical characteristics of severe fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS) in China: an integrated data analysis [J]. Epidemiol Infect, 2016, 144(6): 1345-54.

[3] MUYLDERMANS S. Nanobodies: natural single-domain antibodies [J]. Annu Rev Biochem, 2013, 82(775-97.

本文完