iScience｜西北大学赵新锋/李倩团队建立血管紧张素II受体1型受体（AT1R）双位点固定化方法并用于非激动活性配体筛选

撰文︱李  婷，李  倩，赵新锋责编︱方以一，王思珍编辑︱杨彬薇

以中药为源泉的创新药物研发已成为分析化学、生命科学和中药学等众多学科交叉领域的重点课题。然而中药及其复方原药成分十分复杂，迫切需要高效活性成分筛选技术，以缩短新药研发进程。以固定化蛋白质为核心的受体色谱法已广泛应用于中药等活性成分筛选，为中药新药创制研究提供了有效手段，该类方法的核心在于高活性受体固定相的制备。然而，现有固定化方法在稳定蛋白质活性构象态方面缺乏切实可行的手段，使得受体色谱无法区分激动剂、拮抗剂和别构配体，迫切需要发展新型受体色谱固定相，以降低后期研发风险[1-2]。

2022年10月，西北大学生命科学学院赵新锋研究组在国际学术期刊iScience在线发表了题为“Aptamer-assisted two-point immobilized agonist-bound angiotensin II type 1 receptor for a second-site modulator discovery”的研究，该研究通过SELEX技术，筛选获得了能够稳定AT₁R拮抗剂结合构象态的核酸适配体，并将该适配体与血管紧张素II（3-8）同时修饰于聚苯乙烯氨基微球（APS）表面，利用AT₁R-适配体和AT₁R-血管紧张素II（3-8）的双重作用力，将受体成功固定于微球表面，制备拮抗剂结合构象态AT₁R色谱固定相，用色谱法实现了受体激动剂和拮抗剂的区分。在此基础上，将该固定相应用于中药丹参活性成分筛选，并发现了其中潜在的受体拮抗剂迷迭香酸和别构配体人参皂苷Rg1。该研究为稳定构象态受体的固定化提供了方法，为受体色谱法同步筛选和鉴别受体激动剂、拮抗剂和别构配体提供了思路。

作者建立了一种基于色谱技术的适配体SELEX筛选方法，通过His标签与NTA间的特异性反应，将AT₁R固定于APS表面，获得AT₁R色谱固定相，用于该受体的特异性适配体筛选（图1）。如图1b-c所示，当流动相中添加或不添加替米沙坦时，初始文库在AT₁R色谱柱上均显示两个明显色谱峰。保留时间较短的色谱峰为非特异性DNA分子，收集保留时间较长的色谱峰进行对称PCR和不对称PCR，进行下一轮DNA文库的制备，重复该步骤至第十一轮筛选。结果表明，随着筛选轮数的增加，特异性DNA明显富集，且筛选所得DNA与AT₁R亲和力明显增加。

图1 基于色谱技术的适配体SELEX筛选方法

（图源：Jiajun Liu, et al., iScience, 2022）

选择第十一轮筛选所得DNA进行高通量测序分析，以富集指数、二级结构和与受体亲和力等参数为指标，在优选的四个适配体序列中，最终确定序列A2为能够稳定AT₁R拮抗剂结合态的最优适配体。将该适配体与血管紧张素II（3-8）同时修饰于聚苯乙烯氨基微球（APS）表面，利用AT₁R-适配体和AT₁R-血管紧张素II（3-8）的双重作用力，将受体成功固定于微球表面，制备拮抗剂结合构象态AT₁R色谱固定相，合成路线如图2a所示。采用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱和元素分析等表征手段，证明了AT₁R已成功固定于微球表面（图2）。

图2 AT₁R双位点固定及表征

（图源：Jiajun Liu, et al., iScience, 2022）

色谱结果显示，AT₁R激动剂血管紧张素II和血管紧张素II（3-8）在双位点固定化AT₁R色谱柱上均不保留，在单位点固定化AT₁R色谱柱上保留良好，而奥美沙坦等AT₁R拮抗剂在两根色谱柱上均有保留，提示所建立的双位点固定化AT₁R能够识别受体激动剂和拮抗剂。作者通过非线性色谱法[3,4]获得了奥美沙坦等药物与AT₁R的结合常数、结合速率常数和解离速率常数，结果显示，双位点固定化受体色谱柱获得的结合参数更为准确（图3）。

图3 非线性色谱法测定五种拮抗剂与AT₁R的结合参数

（图源：Jiajun Liu, et al., iScience, 2022）

采用该双位点固定化AT₁R色谱柱对丹参提取液进行筛选，获得的保留成分经质谱鉴定为人参皂苷Rg1和迷迭香酸（图4a,b）。分子对接结果显示，迷迭香酸和人参皂苷Rg1分别结合于AT₁R的正构位点和别构位点（图4c,d）。Western blot和胞内钙释放[5]结果显示，迷迭香酸为潜在的AT₁R拮抗剂，人参皂苷Rg1可能为该受体的别构配体（图4e-h）。

图4 双位点固定化AT₁R色谱模型靶向筛选丹参水提液中活性成分

（图源：Jiajun Liu, et al., iScience, 2022）

图5 双位点固定化AT₁R方法建立及在中药非竞争剂活性成分筛选中的应用

（图源：Jiajun Liu, et al., iScience, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者建立了一种基于核酸适配体和激动剂的双位点固定化AT₁R的方法，该方法能够稳定受体拮抗剂结合构象态，能够在线区分受体激动剂与拮抗剂（图5）。将其应用于中药等复杂体系中靶向活性成分的筛选，可同步筛选和鉴别受体激动剂、拮抗剂和别构配体，为中药等高活性成分筛选提供了新方法。该方法可广泛应用于其他功能蛋白质稳定构象态的高活性固定，对于靶向成分的高活性筛选具有重要意义。然而，本研究通过核酸适配体和受体多肽类激动剂作为连接臂实现受体的双位点固定，由于其成本较高，不适用于大规模高活性AT₁R固定相制备的制备，需进一步开发低成本、规模化、高活性的受体色谱固定相。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222016339

该研究获得了国家自然科学基金委（21974107，22074118）、陕西省科技厅（2020ZDLSF05-07，2022KJXX-70）和陕西省中医药管理局（2021-04-22-005，2022-SLRH-YQ-007）的项目资助。

通讯作者：赵新锋（左一），李倩（左二）

（照片提供自：赵新锋/李倩团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

赵新锋，教授，博士生导师，西北大学中药学/药学学科负责人，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室副主任。中国中医药信息学会科技创新与成果转化分会常务理事，中国药学会药物分析专业委员会委员，陕西省色谱分析科学与技术专业委员会副秘书长，陕西省药学会药物分析专委会委员，陕西省中药产业技术创新战略联盟理事，《Chinese Medicine》、《药物分析》和《世界科学技术-中医药现代化》等杂志编委。近年来，主要致力于药物分析新方法的创建及其应用研究，开展了以药物活性成分多靶点辨识为目标的受体色谱创建研究和应用研究。主持国家自然科学基金项目4项，陕西省重点研发计划重点产业创新链（群）项目1项，陕西省中医药管理局项目2项，企业重要委托课题3项；作为主要完成人，参与国家“重大新药创制”重大专项项目等2项及其他省部级重大科研项目21项；在Science，Journal of the American Chemical Society，Chemical Science，Analytical Chemistry和Journal of Medicinal Chemistry等国际权威期刊上发表学术论文70余篇；获中国发明专利授权6项（5项已转让），提交国际PCT专利申请3份，出版专著1部，获软件著作权1项；获陕西省科学技术一等奖2项、陕西高等学校科学技术一等奖4项；获西部药学之星、陕西省中青年科技创新领军人才和西安青年科技人才等荣誉称号。

李倩，副教授，硕士生导师，陕西省青年科技新星。近年来，主要致力于中药功效物质分析技术创建及应用。主持国家自然科学基金项目2项，中国博士后基金面上项目（一等资助）1项，西北大学“青年学术英才支持计划”项目1项；以第一或通讯作者在Journal of the American Chemical Society，Chemical Science和Analytical Chemistry等国际权威期刊上发表学术论文20余篇；获陕西省科学技术进步奖一等奖1项，陕西省科学技术奖二等奖1项，陕西高等学校科学技术奖一等奖2项；授权中国发明专利4项，形成软件著作权1项。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Bilal M, Asgher M, Cheng H.R., Yan, Y.J., and Iqbal, H.M.N. Multi-point enzyme immobilization, surface chemistry, and novel platforms: a paradigm shift in biocatalyst design. Cri. Rev. Biotechnol. 2019; 39: 202-219.

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[3] Li Q, Wang J, Zheng, YYQ, Yang, LJ, Zhang, YJ, and Bian, LJ. Comparison of zonal elution and nonlinear chromatography in determination of the interaction between seven drugs and immobilized β2-adrenoceptor. J. Chromatogr. A. 2015; 1401:75-83.

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本文完