CDD | 唐靖/刘志峰团队合作揭示EGFR激酶活性和Rab GTPases协调EGFR胞内转运调控脓毒症巨噬细胞极化

撰文︱张学弟责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

脓毒症是指身体对病原体感染的先天免疫反应失调引起的组织损伤甚至危及生命的多器官功能障碍综合征[1]。作为先天免疫系统的重要组成部分，巨噬细胞的持续过度激活在脓毒症器官损伤中起关键作用。脓毒症期间多条信号通路协同启动的细胞代谢级联反应（Metabolic cascades）调控巨噬细胞极化。在脓毒症早期巨噬细胞利用糖酵解供能向M1极化，释放促炎因子，吞噬病原体。随着脓毒症进一步发展，巨噬细胞糖酵解水平下降，转变为氧化磷酸化为主的M2极化，分泌抑炎症细胞因子，促使组织愈合修复[2]。巨噬细胞M1/M2表型之间的平衡对于控制过度炎症和触发组织修复至关重要。因此，寻找调节免疫细胞功能的关键代谢靶点对于开发治疗脓毒症药物具有重要意义。

表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，参与调节巨噬细胞LPS/TLR4信号传导[3]。唐靖课题组前期研究也发现，EGFR磷酸化协同TLR4调节内毒素血症中巨噬细胞的激活[4]。然而，作为膜受体分子，EGFR在巨噬细胞极化中的细胞内运输过程及其对细胞能量代谢的作用仍不清楚。

2022年11月07日，广东医科大学附属医院麻醉科唐靖课题组与解放军南部战区总医院刘志峰课题组合作在Cell Death & Disease上发表了题为“EGFR tyrosine kinase activity and Rab GTPases coordinate EGFR trafficking to regulate macrophage activation in sepsis”的研究。该研究系统地分析了EGFR在巨噬细胞炎症期间的亚细胞转运过程，以及TLR4/EGFR信号通过代谢重编程调节巨噬细胞M1/M2极化，从而调控脓毒症急性肺损伤的分子机制，对深入认识巨噬细胞活化及脓毒症急性肺损伤的潜在治疗策略提供理论依据。

首先，研究者检测了体外内毒素血症模型、小鼠盲肠穿孔脓毒症模型以及临床脓毒症病人的巨噬细胞膜上的EGFR蛋白表达情况。结果发现，相对于对照组，体外和体内的脓毒症模型下的巨噬细胞膜表面表达高水平的EGFR蛋白，而使用EGFR激酶活性抑制剂（PD168393/Erlotinib）可以显著下调巨噬细胞膜表面EGFR的表达水平（图1A-E）。这些数据提示，内毒素诱导巨噬细胞活化过程中促进EGFR细质膜转位。同时，EGFR的激酶活性可能参与调控EGFR自身的胞内转运过程。

图1 LPS诱导巨噬细胞表面EGFR的表达增多

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

EGFR磷酸化的抑制能够显著降低了EGFR在巨噬细胞膜上表达，这表明EGFR激酶活性在自身膜受体运输中起重要作用。为了发现EGFR激酶活性的下游靶点，该研究进行了定量无标签LC-MS/MS蛋白质组学，结果提示Rab7a是EGFR激酶下游潜在的靶点蛋白。Rab7a是Rab GTPases蛋白家族成员之一，已被报道参与调节内吞作用介导的细胞膜受体蛋白质转运[5]。首先，实验证实EGFR抑制剂能够下调LPS诱导的Rab7a磷酸化水平。接下来，作者构建了野生型的Rab7a-WT、磷酸化失活突变体Rab7a-S72A和模拟磷酸化增强突变体Rab7a-S72E，通过一系列细胞实验验证了S72是LPS诱导Rab7a磷酸化的位点（图2A-J）。Rab7a介导膜囊泡（membrane vesicles）调控的细胞膜EGFR内吞降解，维持静息状态巨噬细胞膜上EGFR低表达水平。LPS诱导或者S72E突变均能使S72位点磷酸化导致Rab7a蛋白失活，阻碍EGFR内吞降解过程，致使EGFR在质膜积累，进一步加重巨噬细胞的炎症反应。

图2 LPS诱导Rab7a在S72上发生磷酸化

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

MAPK14（p38α）是p38丝裂原活化蛋白激（p38MAPK）家族成员之一。EGFR的激活可致使细胞内酪氨酸激酶磷酸化，从而启动包括Ras-MAPK在内的一连串的细胞内信号途径[6]。作者进一步发现，MAPK14与Rab7a互作，MAPK14可以直接与Rab7a结合并磷酸化Rab7a的S72位点。通过一系列实验验证了MAPK14介导的Rab7a磷酸化调控LPS激活巨噬细胞中EGFR的晚期内吞作用和降解，进而调节EGFR在细胞膜上的表达水平（图3A-O）。

图3 MAPK14结合并磷酸化Rab7a的S72位点

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

为了更全面地研究巨噬细胞炎症反应期间EGFR胞内转运的机制，作者继续探讨其他小G蛋白是否也参与EGFR转运。Rab5a是膜受体内吞作用的关键调节分子，作者通过免疫共沉淀和免疫荧光等实验验发现Rab5a直接结合EGFR。作者还构建了Rab5a基因敲除小鼠，进一步验证了Rab5a缺失症有效抑制LPS诱导早期（1h）的巨噬细胞膜表面EGFR表达的下降（图4A-L）。这些结果提示Rab5a直接参与调控巨噬细胞活化期间EGFR早期受体内吞事件。接着，作者继续探讨介导EGFR从胞质转运至细胞膜的调控分子。首先，亚细胞定位和免疫共沉淀验实验验证Rab10直接结合EGFR。然后，作者通过构建Rab10敲低以及Rab10酶活性突变体稳定表达的巨噬细胞系，进一步发现Rab10直接参与调控巨噬细胞活化期间EGFR从高尔基体转移到细胞膜（图5A-M）。

图4 Rab5a调控巨噬细胞活化期间EGFR早期受体内吞

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

图5 Rab10调控巨噬细胞活化期间EGFR质膜转位

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

接着，为了评估细胞膜EGFR激活对内毒素血中巨噬细胞M1/M2表型平衡的影响，研究者通过荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、流式细胞术实验等一系列实验，分别在体外和体内水平上验证了使用EGFR抑制剂能够促进内毒素血症下M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转换。为了探讨细胞代谢方式改变是否参与这一过程，作者利用整体代谢组学的技术分析，发现EGFR抑制剂下调PKM2/HIF-1ɑ依赖性糖酵解从而抑制内毒素血症诱导的巨噬细胞M1极化（图6J-M），同时，抑制EGFR可以上调PPARγ诱导的谷氨酰胺代谢进而调控巨噬细胞M1/M2极化表型转化（图7J-K）。

图6 抑制EGFR磷酸化抑制糖酵解依赖的巨噬细胞M1极化

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

图7 抑制EGFR磷酸化通过激活PPARγ调节谷氨酰胺代谢来促进M2极化

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

为了进一步验证EGFR抑制剂对体内炎症和巨噬细胞极化的影响，作者通过在体给予EGFR抑制剂Erlotinib，并建立LPS和CLP诱导的脓毒症急性肺损伤（ALI）小鼠模型，发现EGFR抑制剂给药组相对于单纯脓毒症组小鼠的肺组织损伤减轻，小鼠肺泡灌洗液M1巨噬细胞比例减少，M2巨噬细胞比例上升，同时，小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞浸润减少（图8A-J）。这些结果表明，EGFR抑制剂通过调节巨噬细胞极化表型转换和减少体内炎症来改善脓毒症相关的急性肺损伤。

图8 EGFR抑制剂改善脓毒症相关的急性肺损伤

（图源：X. Zhang, et al., Cell Death Dis, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究首次发现脓毒症巨噬细胞表面EGFR的表达增多，并详细阐述了EGFR在巨噬细胞活化的整个细胞转运过程。机制上，该研究利用磷酸化蛋白质组学，筛选并验证了Rab7a在S72位点的磷酸化阻碍了内毒素血症中EGFR从早期到晚期内吞体的转化，Rab7a磷酸化使其GTP酶失活，这阻断了膜受体-溶酶体降解途径导致质膜EGFR的高表达。该研究进一步证明了Rab10调控EGFR从高尔基体运输到细胞膜，而Rab5a介导EGFR的早期从细胞膜的内吞作用。这些Rab GTPases分子协同调节EGFR在细胞膜表达水平。此外，该研究还发现抑制EGFR磷酸化能够促进促炎型M1巨噬细胞转向抑炎型M2巨噬细胞转换，从而缓解脓毒症相关的急性肺损伤。在利用整体代谢组学技术的基础上，该研究进一步阐明了EGFR抑制剂通过PKM2/HIF-1ɑ途径抑制糖酵解依赖性M1极化，通过上调PPARγ诱导的谷氨酰胺代谢促进巨噬细胞M2极化。总而言之，该研究通过深入分析EGFR调控脓毒症巨噬细胞激活的机制，证明了EGFR有望作为脓毒症治疗的一个有价值的潜在靶点。

目前有观点认为脓毒症的治愈率低下可能与脓毒症的异质性有关，而感染源的差异是脓毒症异质性原因之一[7]，因此在筛选脓毒症免疫调节靶点时应考该靶点与感染类型的关系。但是在本研究中，作者没有全面验证EGFR在不同感染类型中巨噬细胞活化的作用及其潜在机制，这个研究的局限性可能会限制EGFR抑制剂的潜在临床效益，后续可继续从这方面进一步进行研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-022-05370-y

广东医科大学附属医院麻醉科唐靖教授与解放军南部战区总医院刘志峰教授为该论文的共同通讯作者，广东医科大学麻醉学专业博士研究生张学弟和硕士研究生陈翠平为第一作者。本研究得到了中国自然科学基金项目（81873951，82072208）和国家重点研发计划2021YFC2701700的资助。

通讯作者：唐靖

（照片提供自：唐靖团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

唐靖，博士，主任医师，教授、博士生导师，广东医科大学，广东医科大学附属医院麻醉手术中心主任，广东医科大学附属医院慢性疼痛专病中心负责人，2017年广东省第一批杰出青年医学人才、2019年广东省医学会麻醉学分会第一届5佳优秀青年麻醉医师、加拿大西安大略大学药理学博士后、美国匹兹堡大学高级访问学者。任中华医学会麻醉学分会基础研究与应用基础研究学组委员、广东省医师协会麻醉学分会常务委员、广东省行业协会麻醉学分会副主任委员、中华医学会广东省疼痛委员会青年副主任委员、广东省医院管理协会湛江市疼痛学分会主任委员。从事脓毒症免疫调控方向研究，以第一作者或通讯作者在Protein cell, Journal of Advanced Research, Mil Med Res, Br J Anaesth, Semin Cancer Biol, Cell Death Dis等国际知名期刊发表麻醉学专业相关论文33篇，其中SCI收录30篇，累计影响因子超200，单篇论文他引次数最高132次。主持国家自然科学基金四项、科技部十四五重点研发项目子课题一项、广东省自然科学基金及科技计划六项（含重点项目一项）。

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参考文献（上下滑动阅读）

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[2] Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 2012 Mar;122(3):787-95. doi: 10.1172/JCI59643. Epub 2012 Mar 1. PMID: 22378047; PMCID: PMC3287223.

[3] De S, Zhou H, DeSantis D, Croniger CM, Li X, Stark GR. Erlotinib protects against LPS-induced endotoxicity because TLR4 needs EGFR to signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Aug 4;112(31):9680-5. doi: 10.1073/pnas.1511794112. Epub 2015 Jul 20. PMID: 26195767; PMCID: PMC4534288.

[4] Tang J, Zhou B, Scott MJ, Chen L, Lai D, Fan EK, Li Y, Wu Q, Billiar TR, Wilson MA, Wang P, Fan J. Correction to: EGFR signaling augments TLR4 cell surface expression and function in macrophages via regulation of Rab5a activation. Protein Cell. 2020 Aug;11(8):618-619. doi: 10.1007/s13238-019-00679-5. Erratum for: Protein Cell. 2020 Feb;11(2):144-149. PMID: 32125673; PMCID: PMC7381517.

[5] Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Aug;10(8):513-25. doi: 10.1038/nrm2728. Epub 2009 Jul 15. PMID: 19603039.

[6] Perez Verdaguer M, Zhang T, Paulo JA, Gygi S, Watkins SC, Sakurai H, Sorkin A. Mechanism of p38 MAPK-induced EGFR endocytosis and its crosstalk with ligand-induced pathways. J Cell Biol. 2021 Jul 5;220(7):e202102005. doi: 10.1083/jcb.202102005. Epub 2021 May 25. PMID: 34032851; PMCID: PMC8155814.

[7] Leligdowicz A, Matthay MA. Heterogeneity in sepsis: new biological evidence with clinical applications. Crit Care. 2019 Mar 9;23(1):80. doi: 10.1186/s13054-019-2372-2. PMID: 30850013; PMCID: PMC6408778.

本文完