iScience︱李朝阳/赵金存/陈新文团队合作建立细胞膜外表面受体鉴定体系

撰文︱高山山，李朝阳

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

蛋白质的相互作用（PPI）参与细胞的所有生命活动。在所有的PPI中，细胞膜表面受体和配体的相互作用因为其在生理及病理过程中的重要性而尤其受到关注。但是，由于受体是跨膜蛋白且往往是多次跨膜蛋白，其表达纯化过程复杂并且纯化过程中构象很难保持，导致其活性受到影响。而参与和受体相互作用的配体往往需要二聚、三聚甚至多聚才能以较高的亲和力和配体结合。一系列的鉴定受体和配体相互作用的方法被科学家开发出来并获得广泛应用，这些方法包括全基因组敲除、免疫共沉淀、酵母双杂交等等[1, 2]。但是在使用过程中，这些方法的缺陷也逐步显示出来。比如：全基因组敲除耗费巨大而且所需时间和人力成本都不低；免疫共沉淀受限于所能使用的抗体有限且反应条件需要优化等等。近些年出现的基于邻近标记（proximity labelling）技术鉴定PPI操作简单且有效地降低了时间和人力成本[3]，但限于反应条件，这类技术到目前为止主要用于检测细胞膜内的PPI，而受体-配体的相互作用发生于细胞膜外，缺少反应高效发生所需要的部分条件。而用于检测配体受体相互作用的PPI如pupylation-based interaction tagging需要纯化配体-PafA蛋白，且PafA本身分子量较大，限制了配体蛋白的选择[4]。因此，发展出一种普适性配体-受体鉴定方法具有重要的生理学和病理学意义。

近日，广州医科大学附属肿瘤医院、呼吸疾病国家重点实验室李朝阳教授，呼吸疾病国家重点实验室、呼吸疾病国家临床研究中心、广州呼吸健康研究所、广州医科大学附属第一临床医院赵金存教授，呼吸疾病国家重点实验室陈新文研究员课题组合作在iScience上发表了题为“GPI-Anchored Ligand-BioID2-Tagging System Identifies Galectin-1 Mediating Zika Virus Entry”的研究。该研究基于磷脂酰肌醇锚蛋白（GPI-AP）的生物学特性，将二代生物素连接酶（BioID2）和病毒受体结合蛋白（RBP）做成磷脂酰肌醇锚定的重组蛋白（GPI-BioID2-RBP）表达到病毒易感细胞膜表面的脂筏区，实现了对病毒受体的特异性标记，该方法的建立对于发现新的细胞膜表面PPI具有重要意义。

病毒粒子通过受体的介导进入易感细胞进行复制，因此受体的表达在很大程度上决定了病毒感染的趋性[5, 6]。但是参与和受体相互作用的病毒颗粒衣壳蛋白或糖蛋白（RBP）往往以寡聚体的形式与受体结合，并且这些RBP上具有的翻译后修饰在一定程度上会协助受体-配体相互作用。通过对BioID2-RBP进行修饰，将其引导进入内质网并添加上GPI锚，GPI-BioID2-RBP最后经由反向高尔基体网络（TGN）分泌到细胞膜表面的脂筏区（图1）。

图1. GPI-BioID2-RBP重组蛋白的构建和表达。

A. RBP在氨基端前导肽的引导下进入粗面内质网（RER），并在RER中将羧基端的GPI识别信号肽置换成GPI锚（GPI anchor）从而形成GPI-AP。B.GPI-AP经由反面高尔基体网络（TGN）运输分泌到细胞膜表面。C.通过GPI anchor定位于脂筏中。D.定位于脂筏中的GPI-AP具有流动性，且可在脂筏中形成寡聚体。如果这个GPI-AP带有RBP，那么在细胞膜表面的流动过程中可能和相应的受体结合。而利用生物素连接酶的邻近标记特点，该受体就能被生物素化进而被纯化并通过质谱鉴定出来。

（图源：Gao et al., iScience, 2022）

研究人员首先确立了GPI-BioID2-RBP在细胞膜表面具有最适生物素连接酶活性的条件，发现外源添加2 mM的ATP后16个小时酶活性最适，同时胎牛血清（FBS）中的生物素（Biotin）必须被清除并确定了清除方法（图2）。

图2. 确立GPI-BioID2-RBP重组蛋白具有生物素连接酶活性的条件。

A.通过磷脂酰肌醇锚特异性的磷脂酶C处理证实GPI-BioID2-RBP是GPI-AP。B.确定外源添加ATP的最适浓度和最佳酶活时间。C.确立清除FBS中biotin所需要的条件。D.证实在外源加入ATP和消除biotin后，GPI-BioID2-RBP具有生物素连接酶活性，且标记蛋白多为非GPI-AP。

（图源：Gao et al., iScience, 2022）

随后通过比较水疱性口炎病毒（VSV）和寨卡病毒（ZIKV）相应的受体LDLR及AXL[7-9]，发现病毒的RBP确实决定了受体的特异性结合。即GPI-BioID2-RBP（ZIKV）只能特异性地识别AXL而不能识别LDLR；相应的，GPI-BioID2-RBP（VSV）只能识别LDLR。并且GPI-BioID2-RBP（ZIKV）在非变性条件下主要以二聚体或三聚体形式存在，但GPI-BioID2-RBP（VSV）在非变性条件下主要以三聚体或四聚体形式。研究人员进一步阐明了GPI锚对于该体系特异性的重要意义。当GPI锚被置换成VSV糖蛋白本身的跨膜域(TD)后，TD-BioID2-RBP (VSV)不再存在于细胞膜表面的脂筏中，在非变性条件下以多聚体形式存在。虽然TD-BioID2-RBP (VSV)具有和GPI-BioID2-RBP（VSV）相当的生物素连接酶活性，但是其不能特异性地和LDLR相互作用（图3）。

图3. 确定受体鉴定特异性所需要的元件。

A.RBP (V)-BioID2-GPI在非变性条件下主要作为三聚体或四聚体存在，且能够和LDLR出现特异性结合。B.BioID2-RBP (Z)-GPI在非变性条件下主要以二聚体或三聚体形式存在，且能特异地结合ZIKV的受体AXL但是不能结合VSV的受体LDLR。C.将GPI锚置换为跨膜蛋白（TD）后，BioID2-RBP (V)-TD重组蛋白在非变性条件下以寡聚体形式存在，且不能特异性地结合其受体LDLR。

（图源：Gao et al., iScience, 2022）

鉴于AXL作为ZIKV感染的受体存在广泛争议[10-13]，在确立了该体系的工作条件并阐明了其与受体特异性作用的元件后，研究人员利用这个方法探寻了ZIKV感染小鼠的潜在受体。研究发现半乳糖凝集素1（Galectin-1）是协助ZIKV进入宿主细胞的吸附因子并阐明了ZIKV进入宿主细胞A549可以利用Galectin-1和酪氨酸蛋白激酶受体（Axl）两条不同途径。最终研究人员通过对Galectin-1基因敲除（Lgals1^-/-）小鼠的实验证实Galectin-1具有介导ZIKV感染的生理功能（图4）。

图4. Galectin-1是介导ZIKV感染小鼠的重要宿主因子。

A.Lgals1^-/-小鼠相比同笼同性别Lgals1^+/+小鼠对于ZIKV的感染具有更强的抗性。B. Lgals1^-/-小鼠的脑、肝脏、肌肉和血清中ZIKV的滴度显著低于Lgals1^+/+小鼠的相同组织。C. Lgals1^-/-小鼠的心脏、海马、纹状体和睾丸所出现的ZIKV感染后的病理症状明显少于Lgals1^+/+小鼠的相同组织。

（图源：Gao et al., iScience, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究确立了GPI-BioID2-RBP在细胞膜外表面脂筏中具有生物素连接酶活性的条件，阐明了GPI-BioID2-RBP对病毒受体特异性标记的两个必要元素是GPI锚和RBP。在此基础上，该研究明确了AXL作为ZIKV辅助受体的机制并阐明了小鼠galectin-1对ZIKV感染的重要性。该方法的建立对于发现新的细胞膜表面PPI具有重要意义。虽然该体系具有理论上的通用性，即只要知道或能预测受体-配体结合域，都可以采用这个方法鉴定出相应的配体或受体，且易于操作并省时省力，对于实验经费的要求相对不高。但对部分依赖于病毒颗粒上四级结构才能和受体有效结合的配体，该体系的应用可能受到限制。此外，该体系的应用依赖于易感细胞，在使用该体系前需要知道或鉴定出易感细胞。最后，BioID2在加入外源biotin及ATP后需要16个小时才达到最适活性，而三代生物素连接酶在相同条件下只需要10-30分钟就能达到最适活性[14]，是否可以用三代生物素连接酶替代BioID2而获得更高的信噪比值得进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105481

第一作者：高山山（左）；通讯作者：李朝阳教授（中）、赵金存教授（右）

（照片提供自：李朝阳/赵金存教授课题组）

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本文完