PNAS︱苏乾/金大勇团队报道细胞内纳米温度计同时监测溶酶体和线粒体温度动态变化

撰文︱苏  乾，狄香君

责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

细胞内的温度动态变化反映了细胞和生物体的生理健康状况。其中，溶酶体（lysosomes）和线粒体（mitochondria）在时空和功能上高度协作：溶酶体中的生物酶活性极大依赖于细胞质的温度，而线粒体通过氧化呼吸底物和合成ATP来调节活细胞内的温度动态平衡，热量作为活跃新陈代谢的副产物被释放出来。两种细胞器的协作与多种生理过程和疾病相关，如细胞增殖、细胞迁移、细胞自噬和凋亡等。开发可靠且灵敏的细胞内测温探针和工具，并用于研究两种细胞器在时间、空间和功能，尤其是温度上的动态互作，有着重要的细胞生物学和生理学意义[1, 2]。

2022年11月3日，澳大利亚悉尼科技大学苏乾博士、金大勇教授等人合作在美国国家科学院院刊PNAS上发表了题为“Spatiotemporally mapping temperature dynamics of lysosomes and mitochondria using cascade organelle-targeting upconversion nanoparticles”报道了两种基于上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticle，UCNPs）的细胞内纳米温度计，LysoDots和MitoDots，可以实现对活细胞中溶酶体和线粒体同时进行靶向原位温度监测[3]。

本文首先改进了研究组之前工作中对于上转化纳米颗粒的表面修饰方案[4]。如图一所示，研究者用聚赖氨酸（Poly-L-Lysine [PLL]）替代聚乙二醇（PEG）做为连接分子，在保持单颗粒分散度的同时，将纳米颗粒的发光强度提高了三倍，显著提升了细胞内温度计的灵敏度和精确度。

图1 基于上转化纳米颗粒的细胞内温度计表面修饰策略

（图源：Di et al., PNAS, 2022）

实验结果显示，经过表面修饰后上转化纳米颗粒依然具有优秀的温度响应，其在525nm 和 545nm波长处发光强度（I525和I545）的比例与绝对开尔文温度（K）遵从布尔兹曼分布：

并且该发光和温度的关系不受外界离子（钙离子，镁离子和钾离子），酸碱度（pH 4-10），折射率以及不同溶液和药物处理的影响。研究者还发现UCNPs@PLL@TPP较之前报道的UCNPs@PEG@TPP在靶向线粒体后有近十倍的发光效率提升，进一步改善了细胞内温度计的灵敏度和精确度。

图2 细胞内纳米温度计的稳定性

（图源：Di et al., PNAS, 2022）

研究者通过修饰更小的分子获得了更高的表面官能团密度，并通过时序共定位成像发现纳米温度计在与细胞共孵育后，UCNP@copolymer和 UCNPs@TPP 都通过细胞内吞过程进入细胞和早期内体（early endosome）中。如图三所示，细胞孵育12小时后，UCNPs@copolymer更倾向于停留在溶酶体中，而UCNPs@TPP则在靶向分子TPP的作用下逃逸出溶酶体更倾向于聚集于线粒体中。因此，作者将UCNP@copolymer命名为LysoDots，将UCNPs@TPP命名为MitoDots。研究者还发现LysoDots和MitoDots作为细胞内纳米温度计，拥有近乎一致的温度响应校准曲线，都拥有相对较高的灵敏度（32摄氏度时2.7 % K^-1）和较好的分辨率（较低的不确定性，~0.8 K）。此外，研究者还证实细胞在孵育纳米温度计后，各项细胞功能，溶酶体pH和功能，以及线粒体代谢和功能均不受影响。

图3 LysoDots和MitoDots的细胞器靶向特异性

（图源：Di et al., PNAS, 2022）

最后，该工作通过对细胞施加不同的生物化学刺激检验了LysoDots和MitoDots的原位测温表现。首先，研究者使用无细胞器靶向的钙离子休克（Ca2+ ion shock）处理细胞，发现相较于DMSO处理的对照组，5分钟后溶酶体和线粒体的温度均出现了2-4摄氏度的升高，并在30分钟后都回到了基线附近。随后，研究者使用溶酶体靶向药物氯喹（chloroquine，CQ）处理细胞，发现相较于PBS处理的对照组，10分钟后溶酶体温度出现了2-4摄氏度的降低，并一直保持较低的温度，这也与氯喹作为溶酶体靶向药物提升其pH的功能相符，而线粒体温度保持在基线附近不变。最后，研究者使用线粒体靶向药物（FCCP，线粒体中氧化磷酸化(OXPHOS) 解偶联剂）处理细胞，发现相较于DMSO处理的对照组，线粒体温度在2-5分钟内迅速升高4-8摄氏度并在十分钟后开始降低，而溶酶体的温度升高和降低都较线粒体有1-2分钟的滞后。值得一提的是，研究者发现细胞内基线温度为32.15摄氏度左右，并非外界培养箱设置的37摄氏度，而这一发现也与之前的文献报道相符[5-6]。

图4 溶酶体和线粒体的不同温度动态变化

（图源：Di et al., PNAS, 2022）

文末，在表一中，作者还详细总结了利用细胞内温度计进行线粒体原位测温的文献结论，展现了基于上转化纳米颗粒的LysoDots和MitoDots拥有的多细胞器靶向特性和优秀的光学特性优势。

表1 利用细胞内温度计进行线粒体原位测温的文献整理

（表源：Di et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望以上结果展现了溶酶体和线粒体在不同刺激下表现出不同的反应时间和动态温度变化特征，展现了潜在的细胞器互作和温度传导，突出了纳米温度计在原位研究溶酶体与线粒体代谢途径和细胞器间相互作用相关的生命过程的潜在应用，并拓展了多合一纳米粒子实现功能性成像的可能性。未来工作中，研究者将致力于改善本文中纳米颗粒尺寸，实现快速动态化观察并结合超分辨成像技术，进一步提高纳米温度计的靶向性，开发更多细胞器靶向的温度探针，实现更多细胞系功能性互作成像平台。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.2207402119

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参考文献（上下滑动阅读）

1. Deus, C. M., Yambire, K. F., Oliveira, P. J., & Raimundo, N. (2020). Mitochondria–lysosome crosstalk: from physiology to neurodegeneration. Trends in molecular medicine, 26(1), 71-88.

2. Zhou, J., Del Rosal, B., Jaque, D., Uchiyama, S., & Jin, D. (2020). Advances and challenges for fluorescence nanothermometry. Nature methods, 17(10), 967-980.

3. Di, X., Wang, D., Su, Q. P., Liu, Y., Liao, J., Maddahfar, M., ... & Jin, D. (2022). Spatiotemporally mapping temperature dynamics of lysosomes and mitochondria using cascade organelle-targeting upconversion nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences, 119(45), e2207402119.

4. Di, X., Wang, D., Zhou, J., Zhang, L., Stenzel, M. H., Su, Q. P., & Jin, D. (2021). Quantitatively monitoring in situ mitochondrial thermal dynamics by upconversion nanoparticles. Nano letters, 21(4), 1651-1658.

5. Qiao, J., Chen, C., Shangguan, D., Mu, X., Wang, S., Jiang, L., & Qi, L. (2018). Simultaneous monitoring of mitochondrial temperature and ATP fluctuation using fluorescent probes in living cells. Analytical chemistry, 90(21), 12553-12558.

6. Okabe, K., Inada, N., Gota, C., Harada, Y., Funatsu, T., & Uchiyama, S. (2012). Intracellular temperature mapping with a fluorescent polymeric thermometer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature communications, 3(1), 1-9.

本文完