NAR︱陈守文/王勤团队开发适用于地衣芽孢杆菌及其它工业菌株的新型高效蛋白表达工具的新星

撰文︱张曼玉，陈守文，王勤

责编︱方以一，王思珍

编辑︱王如华

枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌以及谷氨酸棒杆菌等革兰氏阳性菌，具有独特且多样的代谢产物，强大的胞外蛋白合成能力，高细胞密度和高生产力，以及生物安全性等优点，它们作为新兴的合成生物学底盘细胞在食品以及医疗等领域受到特别青睐。研究者在这些菌株中已经开发了一系列表达工具，包括启动子文库、RBS文库以及mRNA5’端茎环结构等[1-5]。然而，与模式生物大肠杆菌相比，高效、可靠、标准化表达元件的缺乏依然是非模式工业菌株急需解决的一个难题，是这些菌株释放巨大潜力并被广泛应用的主要障碍之一。2022年11月16日，湖北大学生命科学学院陈守文、王勤团队在Nucleic Acids Research（NAR）上发表了题为“Engineered Multiple Translation Initiation Sites: A Novel Tool to Enhance Protein Production in Bacillus licheniformis and Other Industrially Relevant Bacteria”的研究。该研究在目的基因的mRNA前导区构建了包含多拷贝核糖体绑定位点 (RBS) 的全新表达工具（PRBS），能够在革兰氏阳性菌地衣芽胞杆菌中使目的基因由多个位点进行翻译起始，从而使蛋白表达量随翻译起始位点的增加而呈梯度上升。

通常认为细菌中基因的翻译由SD序列和起始密码子共同确定唯一的翻译起始位点，然而最近的研究表明，由多个位点开始翻译的现象在细菌中广泛存在[6]。作者通过在地衣芽孢杆菌的mRNA前导区串联多个包含RBS和起始密码字的茎环结构（图1a），使GFP基因能够由多个位点进行翻译起始（图1b），从而表达量随翻译起始位点的增加而呈梯度上升（图1c），当含有六个RBS时，GFP的表达量达到了胞内蛋白的50%以上，为目前已报道的最高水平。不同编码基因在核糖体绑定区域内形成不同的二级结构是影响表达元件一致性的重要因素[7]，而本研究构建的新型表达元件PRBS由于具有多个翻译起始位点，上游进行翻译的核糖体在解旋酶的作用下可以线性化下游翻译起始位点的二级结构[8]，从而消除不同二级结构对翻译效率的影响。为了验证PRBS的鲁棒性和实用性，团队成员在地衣芽孢杆菌中胞外表达工业酶精氨酸酶和角蛋白酶（图1d, e），以及胞内表达单加氧酶用于羟基酪醇的全细胞催化（图1f），结果表明对于不同的蛋白，PRBS均呈现表达量随翻译起始位点的增加而梯度上升的趋势，因此PRBS提供了一系列标准化表达元件能够对不同蛋白实现稳定输出。同时，为了验证新型表达元件PRBS的普适性，研究人员在其它工业菌株中探究了PRBS对蛋白表达的影响。结果表明在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中，蛋白表达和地衣芽孢杆菌呈现相似的趋势，证实了PRBS在不同菌株中的通用性。

图1 适用于地衣芽孢杆菌及其它工业菌株的新型高效蛋白表达工具PRBS

(图源：Zhang MY, et al., Nucleic Acids Res, 2022)

本研究同时也发现了一个有趣的现象，在模式菌株大肠杆菌中，PRBS表达蛋白的输出并未随RBS拷贝数的增加而上升，反而导致了蛋白表达的明显下降，原因是大肠杆菌中PRBS并未导致目的基因从多个位点进行翻译起始。革兰氏阴性菌中转录和翻译是紧密偶联的[9]，而革兰氏阳性菌中则并非如此[10]，这个明显的差异可能是PRBS在大肠杆菌中未能实现多翻译起始的原因。同时作者也大胆猜测PRBS可以有效提高其它革兰氏阳性菌的蛋白表达水平。

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究构建了一种具有高效性、鲁棒性和普适性的全新基因表达元件可用于合成生物学和代谢工程，适用于一系列革兰氏阳性菌底盘细胞。同时，PRBS也为革兰氏阳性菌和阴性菌不同翻译机制的研究提供了线索，其在革兰氏阳性菌中的具体作用机制以及在革兰氏阴性菌中未能引起有效多翻译起始位点的原因均有待进一步研究。

原文链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1039/6830669

通讯作者：陈守文（左）；王勤（右）

（照片提供自：陈守文/王勤团队）

作者简介（上下滑动阅读） 

陈守文教授团队长期从事芽胞杆菌生物技术科研和产业化开发，获得科技部重点研发计划、“973”计划、“863”计划、国家支撑计划、国家科技攻关、国家自然科学基金、教育部新世纪人才支持计划、湖北省科技重大专项等多项国家和省部级课题支持。在地衣芽胞杆菌的系统生物学、代谢组学、代谢工程、蛋白表达、发酵工程等领域取得了系列研究成果，在Metab Eng、Nucleic Acids Res、Chem Eng J、ISME J、ACS Sustain Chem Eng等国际知名专业期刊发表高水平论文70余篇，聚γ-谷氨酸、杆菌肽、酶制剂、天然芳香族产物以及农用微生物菌剂等产品发酵生产技术在我国多家企业推广应用。

王勤副教授主要从事合成生物学和生物材料学的研究，目前主要聚焦标准化表达元件以及地衣芽孢杆菌高效蛋白细胞工厂的构建，在Nucleic Acids Res、Adv Funct Mater、ACS Syn Biol等国际知名专业期刊发表论文20余篇，并获得国家自然科学基金、国家重点研发专项子课题以及多个省级课题支持。

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参考文献（上下滑动阅读）

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[3] Fu, G., Yue, J., Li, D., Li, Y., Lee, S.Y. and Zhang, D. (2022) An operator-based expression toolkit for Bacillus subtilis enables fine-tuning of gene expression and biosynthetic pathway regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 119, e2119980119.

[4] Lee, M.J. and Kim, P. (2018) Recombinant Protein Expression System in Corynebacterium glutamicum and Its Application. Front. Microbiol., 9, 2523.

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[6] Meydan, S., Marks, J., Klepacki, D., Sharma, V., Baranov, P.V., Firth, A.E., Margus, T., Kefi, A., Vazquez-Laslop, N. and Mankin, A.S. (2019) Retapamulin-assisted bibosome profiling reveals the alternative bacterial proteome. Mol. Cell, 74, 481-493 e486.

[7] El Karoui, M., Hoyos-Flight, M. and Fletcher, L. (2019) Future trends in synthetic biology-a report. Front. Bioeng. Biotechnol., 7, 175.

[8] Na, D., Lee, S. and Lee, D. (2010) Mathematical modeling of translation initiation for the estimation of its efficiency to computationally design mRNA sequences with desired expression levels in prokaryotes. BMC Syst. Biol., 4, 71.

[9] Proshkin, S., Rahmouni, A.R., Mironov, A. and Nudler, E. (2010) Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation. Science, 328, 504-508.

[10] Johnson, G.E., Lalanne, J.B., Peters, M.L. and Li, G.W. (2020) Functionally uncoupled transcription-translation in Bacillus subtilis. Nature, 585, 124-128.

本文完