Adv Sci︱南京大学刘震团队报道结合“糖盾”的纳米人工抗体广谱病毒抑制剂

撰文︱李  迎责编︱方以一，王思珍编辑︱杨彬薇

病毒性传染病，特别是新冠肺炎的大流行给人类社会带来了沉重的负担，尽管已经开发了许多包括疫苗、中和抗体和小分子药物在内的预防和治疗方法，但是病毒的快速突变导致了许多中和抗体失效和突破性感染的发生，因此迫切需要开发一种广谱的抗病毒抑制剂。

糖基化是一种普遍的翻译后修饰，负责多种重要的生物学功能。许多病毒，包括艾滋病毒、新冠病毒、甲型流感病毒、拉沙热病毒和埃博拉病毒，利用宿主细胞加工机制在复制过程中用“自身”聚糖修饰它们的蛋白质，广泛糖基化的病毒蛋白有助于逃避宿主的免疫监视[1-4]。许多病毒糖蛋白不遵循经典的分泌途径，跳过了高尔基体中复杂和多样化的糖基化，从而保留了许多未经加工的高甘露糖[5-8]。因此，病毒“糖盾”的保守结构特征（丰富的高甘露糖）是应对不断变异的病毒并实现广谱抑制的潜在靶标。

2022年11月15日，南京大学刘震教授团队、军事科学院军事医学研究院秦成峰研究员团队和江苏省农科院李彬研究员团队合作在Advanced Science上发表了题为“Rational development of hypervalent glycan shield-binding nanoparticles with broad-spectrum inhibition against fatal viruses including SARS-CoV-2 variants”的研究。该研究基于先进分子印迹技术开发了能够结合高甘露糖的纳米人工抗体，通过靶向病毒“糖盾”，不仅能够阻断病毒-受体相互作用，还能够诱导病毒聚集并促进巨噬细胞的吞噬清除作用，对具有高甘露糖的病毒，尤其是新冠病毒（SARS-CoV-2 ）及其变异株展现出强效和广谱的抑制作用。

靶向高甘露糖的病毒中和纳米人工抗体（nanoMIP），是基于最新的反相微乳液分子印迹技术制备的，有机结合了硼亲和作用对糖类分子优异的识别能力。由于高甘露糖模板分子非常昂贵且难以获得，研究者们另辟蹊径，利用反向微乳液体系对大量模板的兼容性，通过印迹甘露糖，实现了对于高甘露糖的识别（图1a）。等温吸附曲线结果显示，单个nanoMIP可以结合超过2500个甘露糖分子，可以同时结合超过50个的高甘露糖分子，这种超多价结合能力实现了从单糖到聚糖识别的跨越（图3a, b）。

图1 病毒中和纳米人工抗体（nanoMIP）的设计路线与合成表征

（图源：Liu, Z. et al., Adv. Sci., 2022）

通过生物膜层干涉法（BLI）表征，nanoMIP对含有高甘露糖的假病毒颗粒亲和力达到了8.5 x 10^-10 M，并且能够完全阻断病毒与受体ACE2的作用。为了进一步证明假病毒与nanoMIP的结合，研究者通过冷冻透射电镜（Cryo-TEM）进行了表征（图2a）。结果显示nanoMIP能够很好的结合在病毒表面，除了一对一的结合外，还观察到了一个病毒颗粒结合多个nanoMIP粒子，这与后续观察到的nanoMIP诱导病毒颗粒聚集是一致的。随后进行了细胞层面的假病毒黏附实验，对照组中可以观察到明显的绿色荧光标记的病毒粒子，而将nanoMIP与病毒预孵育，流式细胞术与共聚焦荧光图中均未观察到明显的病毒粒子，证明了nanoMIP优良的阻断病毒黏附的能力（图2b, c）。

图2 nanoMIP结合病毒并阻断细胞黏附

（图源：Liu, Z. et al., Adv. Sci., 2022）

在负染色透射电镜下，nanoMIP处理后观察到了明显的病毒聚集体，而NIP对照组病毒颗粒仍呈现均匀的分散状态。这种独特的诱导病毒聚集机制，可能是由于nanoMIP对不同病毒颗粒的同时识别导致的，进一步抑制了病毒对宿主细胞的侵染。在这种双重机制——阻断病毒-受体结合和诱导聚集的激励下，研究者们探究了nanoMIP对易感细胞系的保护能力。一种含有新冠病毒刺突蛋白基因组、绿色荧光蛋白基因组和荧光素酶报告基因的假病毒被用于假病毒中和试验。通过暴露于假病毒后48小时的荧光素酶活性测定，nanoMIP 对新冠病毒原始株及其主要变异株（D614G、N501Y、N439K、Δ69-70、Delta和Omicron）表现出约90%的抑制效率，EC50值在纳摩尔水平。作为对照，NIP组对假病毒感染没有明显的抑制作用，证明了靶向高甘露糖以结合病毒策略的有效性。除了新冠病毒以外，还考察了nanoMIP对其他重要的富含高甘露糖的病毒的抑制能力，在假病毒中和实验中，分属不同种类的拉沙热病毒和艾滋病毒对相应宿主细胞系的侵染被抑制了95%以上，更高的抑制效率可能归因于更高的高甘露糖含量。

在真病毒中和实验中，nanoMIP同样保持了优良的抑制能力。以新冠病毒原始株和德尔塔突变株作为实验对象，与阴性对照组相比，nanoMIP治疗组的病毒基因载量下降了三到四个数量级（图3a, b），与一些治疗性抗体效果相当。甘露糖凝集素（MBL）没有表现出明显的抑制能力，表明结合高甘露糖还不足以抑制病毒侵染，而nanoMIP的刚性结构可能具有独到的作用。细胞病变效应（CPE）进一步证明了nanoMIP对真病毒良好的抑制能力，而阴性对照组、NIP处理组和MBL处理组均出现明显的细胞病变（图3c-f）。

图3 nanoMIP真病毒中和实验

（图源：Liu, Z. et al., Adv. Sci., 2022）

最后，研究者还探究了nanoMIP诱导的病毒聚集体对巨噬细胞吞噬作用的影响。巨噬细胞作为一类吞噬细胞，负责吞噬和清除病原体、微生物和其他外来入侵者。由于巨噬细胞的吞噬作用高度依赖于大小，而nanoMIP诱导的假病毒聚集体处于亚微米至微米级，这非常有利于巨噬细胞的摄取。与对照组相比，nanoMIP诱导的病毒聚集体显著增强了巨噬细胞的吞噬作用。这种独特的增强吞噬机制，激活了先天免疫并促进了病毒的清除，进一步阻断了对宿主细胞的侵染。

图4 nanoMIP抑制病毒感染示意图

（图源：Liu, Z. et al., Adv. Sci., 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究开发了一种具有纳米级尺寸和刚性结构的结合“糖盾”人工抗体，可有效且广谱地抑制多种病毒。可控合成的nanoMIP具有对甘露糖的超多价结合能力（单个纳米颗粒上超过2500个结合位点）。以野生株新冠假病毒为例，nanoMIP的Kd值达到亚纳摩尔水平。超高亲和力，加上空间效应和刚性结构，使得nanoMIP能够有效阻断病毒和宿主细胞结合。另外，nanoMIP通过同时结合多个病毒粒子诱导病毒聚集，这不仅可以阻止病毒粒子进入宿主细胞，还可以促进病毒粒子的吞噬作用。nanoMIP对多种假病毒表现出强大的广谱抗病毒功效，包括新冠病毒原始株及其主要变体（D614G、N501Y、N439K、Δ69-70、Delta 和 Omicron）、艾滋病毒和拉沙热病毒，EC50 值在10^-9 M左右。此外，在真病毒中和实验中，nanoMIP对新冠病毒原始株和德尔塔突变株同样展示出良好的抑制能力。总而言之，nanoMIP提供了一种全新的策略，将焦点从多变的抗原表位转移到结构较保守的病毒“糖盾”，可以实现对不同种类病毒的广谱抑制。在此基础上，可以进一步发展出更高抑制效率乃至直接杀死病毒粒子的抑制剂，可望将在抗击新冠等烈性病毒方面发挥重要的作用。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202202689

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[1]F. Helle, G. Duverlie, J. Dubuisson, Viruses 2011, 3, 1909-1932.

[2]R. Sommerstein, L. Flatz, M. M. Remy, P. Malinge, G. Magistrelli, N. Fischer, M. Sahin, A. Bergthaler, S. Igonet, J. ter Meulen, D. Rigo, P. Meda, N. Rabah, B. Coutard, T. A. Bowden, P.-H. Lambert, C.-A. Siegrist, D. D. Pinschewer, PLOS Pathog. 2015, 11, e1005276.

[3]A. C. Walls, M. A. Tortorici, B. Frenz, J. Snijder, W. Li, F. A. Rey, F. DiMaio, B.-J. Bosch, D. Veesler, Nat. Struct. Mol. Biol. 2016, 23, 899-905.

[4]Y. Watanabe, J. D. Allen, D. Wrapp, J. S. McLellan, M. Crispin, Science 2020,369, 330-333.

[5]K. J. Doores, C. Bonomelli, D. J. Harvey, S. Vasiljevic, R. A. Dwek, D. R. Burton, M. Crispin, C. N. Scanlan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107, 13800-13805.

[6]G. B. E. Stewart-Jones, C. Soto, T. Lemmin, G.-Y. Chuang, A. Druz, R. Kong, P. V. Thomas, K. Wagh, T. Zhou, A.-J. Behrens, T. Bylund, C. W. Choi, J. R. Davison, I. S. Georgiev, M. G. Joyce, Y. Do Kwon, M. Pancera, J. Taft, Y. Yang, B. Zhang, S. S. Shivatare, V. S. Shivatare, C.-C. D. Lee, C.-Y. Wu, C. A. Bewley, D. R. Burton, W. C. Koff, M. Connors, M. Crispin, U. Baxa, B. T. Korber, C.-H. Wong, J. R. Mascola, P. D. Kwong, Cell 2016, 165, 813-826.

[7]Y. Watanabe, Z. T. Berndsen, J. Raghwani, G. E. Seabright, J. D. Allen, O. G. Pybus, J. S. McLellan, I. A. Wilson, T. A. Bowden, A. B. Ward, M. Crispin, Nat. Commun. 2020, 11, 2688.

[8]C.-C. D. Lee, Y. Watanabe, N. C. Wu, J. Han, S. Kumar, T. Pholcharee, G. E. Seabright, J. D. Allen, C.-W. Lin, J.-R. Yang, M.-T. Liu, C.-Y. Wu, A. B. Ward, M. Crispin, I. A. Wilson, PLOS Pathog. 2021, 17, e1009407.

本文完