NAR︱武汉病毒所龚鹏团队揭示病毒RdRP核苷酸催化循环新机制

撰文︱王美华，李  瑞，龚  鹏

责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

RNA病毒包括多种致病病原，对人类健康构成严重威胁。RNA病毒的基因组复制和转录过程需要自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）来主导完成，该过程经历引发（initiation）、延伸（elongation）和终止（termination）阶段，由数以千计的核苷酸添加循环（nucleotide addition cycle，NAC）组成。该循环的机制不仅是了解RNA病毒本质特征的重要内容，也是发展针对RdRP的抗病毒策略的重要依据。关于病毒RdRP的现有研究表明，每个NAC经历四个步骤：1. 反应底物NTP进入RdRP活性中心；2. RdRP活性中心关闭（active site closure）；3. 核苷酸转移（nucleotidyl transfer）反应发生（产物RNA的3’-末端添加一个核苷酸）；4. RdRP向下一位模板核苷酸转位（translocation）从而开启下一轮循环[1-3]。过去十余年间，结构生物学与酶学研究已基本完整勾勒出该NAC的机制，但始终未能准确获得催化反应（步骤3）即将发生时的RdRP结构信息，因此对于哪些氨基酸残基在催化反应中发挥关键作用仍存在争议。

近期，中国科学院武汉病毒研究所龚鹏研究员团队在Nucleic Acids Research上发表了题为“Crystal structure of a pre-chemistry viral RNA-dependent RNA polymerase suggests participation of two basic residues in catalysis”的研究。该团队通过在肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）RdRP-RNA复合物晶体浸泡实验中的多方尝试，成功解析了高度接近催化反应发生状态的RdRP晶体结构（图1a）揭示了RdRP催化反应的机制。

该研究发现位于RdRP基序D附近的一个赖氨酸残基K360与结构中底物CTP的g-磷酸存在近距离相互作用（3.3埃）。在与EV71同为肠道病毒的脊髓灰质炎病毒的前期研究中，等同的K359残基被认为直接参与了催化反应和其中的质子转移过程，而上述晶体结构中观测到的近距离相互作用进一步提示了这种可能性。据此，该团队选取了EV71 RdRP的K360残基和另一个与CTP的磷酸基团存在相互作用的基序F上的精氨酸残基R174为突变位点设计了系列突变体，利用酶学方法对野生型RdRP和突变体的单步延伸速率常数和CTP米氏常数（图1b）、RdRP延伸状态（elongation）和延伸前状态（pre-elongation）下催化的pH依赖性等多种参数和性质进行了表征。结果表明，K360位点的突变不仅降低了催化效率而且在延伸和延伸前状态下都能影响RdRP的pH依赖特性，而R174位点的突变所造成的影响与K360类似且能额外降低底物CTP的亲和力。

图1 EV71 RdRP K360和R174参与催化反应的结构和酶学基础

（图源：Li Rui et al., Nucleic Acids Research, 2022）

图2 病毒RdRP核苷酸添加循环（NAC）的完整结构基础

（图源：Li Rui et al., Nucleic Acids Research, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究通过晶体浸泡的方法得到了一个接近催化反应发生状态的EV71 RdRP结构，首次观测到了K360与底物NTP的g-磷酸之间的直接相互作用，为K360和R174参与催化反应提供了结构基础。接着通过酶学方法进一步获取了K360和R174均直接参与催化反应的证据，但这两个残基是否直接参与质子转移仍有待进一步取证。另外K360在RdRPs中并不普遍保守，其他RdRPs与K360等同位置上的氨基酸是否有类似功能也需要进一步阐明。这项工作是该团队继解析RdRP活性中心部分关闭结构（对应NAC步骤2）和揭示不对称转位现象（对应NAC步骤4）等NAC系列工作后的又一项成果（对应NAC步骤3），阐明了该循环的全过程机制（图2），为靶向病毒RdRP的核苷类创新药物理性化设计奠定了关键基础。

原文链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1133/6882138

龚鹏研究员为论文的通讯作者。武汉病毒所博士研究生/博士后李瑞（2021年获得博士学位，主要完成酶学研究）和博士研究生王美华（2021年获得博士学位，主要完成结构生物学研究）为论文的共同第一作者。

共同第一作者：李瑞（后排左八），王美华（后排左七）；通讯作者：龚鹏（前排左三）

（照片提供自：龚鹏实验室）

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参考文献（上下滑动阅读）

1. Gong, P. and O.B. Peersen, Structural basis for active site closure by the poliovirus RNA-dependent RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(52): p. 22505-10.

2. Shu, B. and P. Gong, Structural basis of viral RNA-dependent RNA polymerase catalysis and translocation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(28): p. E4005-14.

3. Wang, M., et al., Stringent control of the RNA-dependent RNA polymerase translocation revealed by multiple intermediate structures. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 2605.

本文完