Diabetes︱约翰斯霍普金斯大学Dax Fu课题组为体内成像和糖尿病治疗提供新工具
撰文︱郭 政
责编︱方以一，王思珍
编辑︱杨彬薇
1型糖尿病 (T1D)又称幼年型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病，是一种慢性疾病，因胰腺中产生胰岛素的β细胞的高度特异性自身免疫性被破坏所致。1型糖尿病占所有糖尿病病例的5％-10[1,2]。据估計全球每年大約有8万名儿童患1型糖尿病[3]。过去数十年里，由于缺乏特异性探针，无法实现对人β细胞群的精确靶向，妨碍了临床环境中治疗药物的递送。目前可用的治疗性生物制剂给免疫系统带来长期甚至不可逆转的变化，从而增加全身感染和恶性肿瘤的风险。因此，开发一种既可以抑制胰岛内部自身反应性免疫细胞，同时又能保持免疫系统的整体能力完好的T1D免疫疗法显得尤为重要。
2022年11月30日，约翰霍普金斯大学医学院生理系Dax Fu课题组在Diabetes在线发表了题为 “A cell-surface autoantibody targets zinc transporter-8 (ZnT8) for in vivo b-cell imaging and islet-specific therapies”的研究论文。科研人员通过建立一种新的免疫策略，成功获得单克隆抗体（mAb43）。该抗体可识别表达在人类和啮齿动物β细胞表面的锌转运蛋白8（ZnT8），同时动物实验证明mAb43可以通过静脉注射靶向胰岛。显示mAb43具有药物靶向和胰岛显影成像的应用价值。
B细胞中只有极小部分可识别细胞表面ZnT8蛋白。由于ZnT8 蛋白胞外域与细胞膜齐平，缺乏抗原表位（图 1A）。此外，ZnT8蛋白的胞外域在哺乳动物中非常保守，使其在物种间也具有抗原惰性（图1B）。因此到目前为止，如何成功克隆靶向细胞表面ZnT8蛋白的单克隆抗体一直困扰着科学界[4]。本文作者通过对比两种免疫策略（图1C和1D），诱导并克隆了靶向ZnT8蛋白的高亲和力细胞表面抗体(mAb43) （图1E，1F，1G）。
图1 抗 ZnT8细胞外域自身抗体的诱导策略和生化表征。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
作者运用共聚焦荧光显微镜对mAb43在人和啮齿动物的β细胞中进行了荧光共定位实验，进一步确定mAb43可与ZnT8跨膜域的细胞外表面结合。结果显示，mAb43与CD71，Na+/K+ ATPase细胞膜标记物一样，可以结合于细胞表面（图2A和2C），同时对人类和啮齿动物ZnT8都表现出了很高的特异性（图2C和2D），且有效阻断T1D病人血清中ZnT8蛋白的自身免疫性抗体（图2E）。
图2 mAb43细胞表面结合和特异性。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
研究人员通过高效液相色谱观察到人ZnT8蛋白可与mAb43结合，而当ZnT8蛋白插入细外域标签后则失去与mAb43结合的能力（图3A和3B）。ZnT8蛋白是同源二聚体，两个ZnT8单体在二聚体中呈现不同构象。在负染色透射电镜下，研究人员也观察到mAb43只与ZnT8同源二聚体中的一个单体形成稳定结合（图3D）。同时免疫印迹实验结果也显示mAb43无法与变性的ZnT8结合（图3C），进一步明确mAb43的抗原表位和构象特异性。
图3 抗原表位和构象特异性。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
胰腺石蜡包埋切片实验显示mAb43可以特异免疫标记小鼠胰岛。胰腺冷冻切片的结果也揭示了人胰岛和mAb43荧光信号的共定位，证明mAb43对人胰岛的特异性（图4A和4C）。通过荧光激活细胞分选实验，研究人员从总胰腺细胞中成功分离出β细胞，进一步证实mAb43对表达ZnT8的胰岛和β细胞的特异性（图4D，4E和4F）。
图4 对小鼠和人类胰岛和β细胞的特异性。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
研究人员用mAb43和细胞膜荧光标记的方法，观察到在活细胞中不同温度和葡萄糖浓度下ZnT8蛋白介导的mAb43细胞表面结合和内吞。研究结果揭示，相较于低温低糖，在37℃和高糖刺激下ZnT8介导的mAb43摄取量增加超过30倍（图5）。
图5 葡萄糖依赖的 ZnT8介导mAb43摄取。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
为探究mAb43的靶向性和体内递送，研究人员通过腹腔注射和静脉注射两种方式，以5mg/kg的抗体使用浓度，为雄性C57BL/6小鼠注射mAb43，然后使用免疫印迹实验检测mAb43在不同组织器官中的分布。接受静脉和腹膜内注射的小鼠，血浆中mAb43在一天内消除（图6A），这与低剂量给药的靶介导抗体清除的小鼠药代动力学模型一致[5]。注射1至6天后，其生物分布特征仍然存在。mAb43的胰腺特异性生物分布充分证明了mAb43具有通过全身给药靶向胰腺的潜在药用价值。
图6 小鼠全身给药后抗体的组织器官分布。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
为评估 mAb43在体内成像的可行性，研究人员向MIP小鼠（在胰岛中特异性表达绿色荧光蛋白GFP）注射了带有红色荧光蛋白（mScarlet）的mAb43-mScarlet。全胰腺成像和局部高倍放大图像结果均显示GFP 和 mScarlet 之间具有高度重合性（图7A，7B和7C）。此外，为检测小鼠胰岛的mAb43摄取，研究人员将小鼠胰岛分别放入加有mAb43-mScarlet或mAb20-mScarlet的培养基中培养。结果显示与mAb43-mScarlet共培养的小鼠胰岛具有专一mScarlet红色荧光。这些发现进一步证明了mAb43具有潜在的活体成像应用价值。
图7 mAb43-mScarlet 小鼠胰岛靶向递送。
（图源：Zheng G. et al., Diabetes., 2022）
综上所述，该研究利用新的免疫策略，成功诱导并克隆结合ZnT8蛋白胞外域的自身反应性抗体-mAb43。通过分子，细胞和动物一系列实验揭示并验证了mAb43对人类和啮齿动物 ZnT8蛋白具有强特异性和高亲和力，同时证明了mAb43在小鼠中的特异性组织分布和胰岛归巢。
mAb43的发现和克隆为科学家们创造了糖尿病靶向治疗的新机会，通过mAb43药物靶向递送实现抑制局部免疫、促进β细胞的增殖和功能恢复，同时又不会引起全身副作用。在过去，医生和科研人员需要测量葡萄糖或胰岛素来推测胰腺状态和功能的变化。而现在， mAb43的β细胞靶向递能力使精确测量β细胞数量和实时观察β细胞的功能成为可能。这些都将改善未来糖尿病领域的研究并为糖尿病的治疗提供更多可能性。
原文链接：https://doi.org/10.2337/db22-0477
实验室Zheng Guo(郭政)博士和Devi Kasinathan博士是该论文的第一作者，Dax Fu教授为通讯作者。
第一作者：Zheng Guo（左），Devi Kasinathan（中）；通讯作者：Dax Fu（右）
（照片提供自：美国约翰斯霍普金斯大学Dax Fu课题组）
通讯作者简介（上下滑动阅读）
Dax Fu是约翰霍斯普金斯医学院生理系副教授。实验室长期致力于将人类胰腺锌转运蛋白结构和功能的基础研究转化为糖尿病的早期诊断和治疗干预。如有兴趣申请Dax Fu实验室博后，请发Email：dfu3@jhmi.edu。
参考文献（上下滑动阅读）
[1] Lemaire, K., Ravier, M. A., Schraenen, A., et al. Insulin crystallization depends on zinc transporter ZnT8 expression, but is not required for normal glucose homeostasis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106, 14872-14877 12.
[2] Nicolson, T. J., Bellomo, E. A., Wijesekara, N., et al.Insulin storage and glucose homeostasis in mice null for the granule zinc transporter ZnT8 and studies of the type 2 diabetes-associated variants. Diabetes, 2009, 58, 2070-2083.
[3] Smith, M. J., Simmons, K. M., and Cambier, J. C. B cells in type 1 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol, 2017, 13, 712-720.
[4]Anubha M., Min J.G., Weihua Z., Genome-wide trans-ancestry meta-analysis provides insight into the genetic architecture of type 2 diabetes susceptibility. Nature Genetics, 2014, 46, pages234–244.
[5] Noguchi, Y., Ozeki, K., and Akita, H. Pharmacokinetic prediction of an antibody in mice based on an in vitro cell-based approach using target receptor-expressing cells. Sci Rep, 2020, 10, 16268.
本文完