Curr Biol｜德国马普所(Tübingen)首次证明捕食性线虫的摄食结构由几丁质组成

撰文︱孙  帅责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

线虫分布在地球表面的所有生态系统，仅每立方米的土壤就可容纳上百万个身长几毫米的线虫，线虫约占多细胞动物的80%。线虫在进化上的成功主要归功于其头部和嘴部区域（口器）对外界环境卓越的适应能力，而产生了极其多样的摄食结构和觅食策略。例如，人类钩虫十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale）的口器可形成两颗坚固的齿牙，能够附着在宿主的小肠上，进而造成严重的组织损伤。

Pristionchus pacificus (P. pacificus)是由德国马克思普朗克生物学研究所（Tübingen）的Ralf Sommer教授团队建立并发展起来的模式线虫体系，目前已具备高质量的参考基因组、多组学功能基因组注释和成熟的分子生物学方法（如基因编辑技术），是开展比较生物学和进化生物学研究的理想模式系统。更重要的是，P. pacificus表现出的口器二态性（Mouth-form dimorphism）为研究发育可塑性（Developmental plasiticity）的分子机制提供了理想模型[1]。口器二态性，指P. pacificus在不同环境条件下可形成两种可选择性的口器（mouth form）, St型口器 (Stenostomatous morph)的嘴部结构较狭窄且仅有单颗小齿（teeth-like denticle），严格地以细菌为唯一食物来源；与其相反，Eu型口器 (Eurystomatous morph)具有较宽的嘴部结构、两颗小齿，能够以细菌和其他线虫为食物来源（图1）。在过去的十几年中，研究者们利用正反向遗传学方法先后鉴定出了决定口器二态性的关键基因和基因调控网络，极大拓展了对调控发育可塑性分子机制的理解[2-4]。然而，线虫口器的结构性基础仍不清楚。阐明线虫口器发育的分子机制对线虫捕食行为的研究及动植物疾病研究有重要意义。

图1 P. pacificus 口器结构和用来的捕食线虫的两颗小齿

（图源：Jürgen Berger/MPI for Biology）

2022年12月1日，德国马克斯普朗克生物学研究所（Tübingen）孙帅博士等在Current Biology发表了题为“Chitin contributes to the formation of a feeding structure in a predatory nematode”的研究长文。该研究系统性地分析了线虫中高度保守的两个编码几丁质和酶的基因，chs-1和chs-2，其中chs-2基因包含60个外显子，形成至少四种转录本亚型。基于基因编辑技术（CRISPR/Cas9），研究者发现当敲除Ppa-chs-2基因的几丁质和酶结构域后会产生线虫早期发育致死表型，然而，当只敲除Ppa-chs-2基因的3’末端则会产生能正常存活且小齿发育缺陷（Teethless）的线虫。此外，用几丁质和酶抑制剂（Nikkomycin Z）处理线虫幼虫也会导致相似的小齿发育缺陷。小齿缺陷突变体虽然仍可以以各种细菌作为食物来源，但不能成功地捕食其他线虫。研究者通过高分辨率的转录组分析发现，Ppa-chs-2基因表达模式为震荡或节律基因（Oscillating/Circadian gene），并受硫酸酯酶编码基因Ppa-eud-1调控，后者为决定线虫口器发育的开关基因（Developmental switch）。综上所述，该研究首次证明了模式线虫 P. pacificus 的摄食结构（小齿）由几丁质组成，这不仅解决了长期存在的线虫口器发育难题，而且也为多达 1000 万种线虫物种的进化研究开辟了新视角。

几丁质是一种非常抗性的多糖，通常被大自然用来形成耐用的结构：它是节肢动物外骨骼的构成成分，如甲壳类动物的壳，也存在于真菌细胞壁中。长久以来，人们一直怀疑几丁质也可能是线虫口器的重要组成部分。然而，由于在线虫口器中几丁质很难被检测到，因此无法明确地证明其存在。为了攻克这一难题，孙帅博士及研究团队首先利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9）对几丁质和酶编码基因Ppa-chs-2进行了多次编辑(图2A, B)。根据基因编辑发生的位置不同，突变体表现出不一致的表型，如线虫胚胎发育致死和线虫小齿发育缺陷(图2C-F)。此外，研究人员将几丁质和酶抑制剂（Nikkomycin Z）注射到线虫野生型（wild type）幼虫的头部，得到了相似表型，即这些被注射的线虫表现为成虫口器发育畸形，两颗小齿发育缺陷。以上两个实验充分证明了几丁质对线虫齿牙形成的重要作用。

线虫口器结构决定了其生活方式。小齿发育缺陷的突变体由于口器畸形，也会导致摄食行为和捕食策略的改变。研究者利用高分辨率的光学显微镜对小齿缺陷突变体的捕食行为进行了跟踪观察，发现这些小齿完全缺陷的突变体仍然试图攻击（捕获）其他线虫幼虫（C. elegans），但因小齿缺陷而无法正常破坏被捕食者的外表皮，成为失败的捕食者。这表明小齿缺陷突变体的自我识别系统[5]正常，仍然能够分清异己，但是，因无正常的口器（小齿）而丧失捕食行为。这可理解为：小齿缺陷突变体捕食能力的丧失，不是因为“食欲不振”，而是由于“力不从心”。

图2 基于基因编辑技术分析表明几丁质和酶在线虫齿牙形成过程中的重要作用

（图源：Sun S, et al., Curr. Biol., 2022）

线虫属于蜕皮动物（ecdysozoan），P. pacificus 在幼虫时期经历三次蜕皮过程（molting）后，发育为成虫。线虫的蜕皮过程较短（约2-3小时），蜕皮过程是外表皮（包括线虫口器）形态重塑的重要时期。研究者首先绘制了蜕皮阶段的高分辨率的转录组图谱[6]，发现几丁质和酶编码基因 Ppa-chs-2 表达模式为震荡基因（节律基因），即在每次蜕皮过程前一小时高度表达，而在蜕皮结束后基因表达沉默。其次，通过构建 Ppa-chs-2 转录报告转基因系（transcriptional reporter lines），发现了 Ppa-chs-2 特异性地高度表达在三类细胞（pm1, e2, and e3），而这三类细胞与线虫小齿结构紧密连接。Ppa-chs-2 基因的特异性时空表达模式进一步证明了几丁质对线虫小齿结构形成的重要作用。最后，研究者通过比较野生型和口器发育缺陷突变体 eud-1 （St型口器）的蜕皮时期转录组数据，鉴定出了由口器发育决定基因 eud-1 上游调控的基因（包括 Ppa-chs-2），发现这些由 eud-1 调控的差异表达基因高度富集在与线虫表皮发育（cuticle development）和咽重塑（pharyngeal reconstruction）相关生物学过程。这一结果首次为假设“口器发育决定基因 eud-1 通过调节不同剂量的几丁质来控制口器二态性”提供了关键证据，为最终阐明线虫齿牙发育提供了分子调控模型(图3)。

图3 P. pacificus 齿牙发育基因调控网络

（图源：Sun S, et al., Curr. Biol., 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究系统性地阐明了几丁质在模式线虫 P. pacificus 齿牙发育过程中的关键作用，由 Ppa-chs-2 基因3’末端敲除或由几丁质和酶抑制剂注射所导致的齿牙突变表型，首次提供了线虫捕食性齿牙发育完全缺陷的实例，为研究线虫摄食行为和捕食策略提供了理想模型。更重要的是，对几丁质组成线虫齿牙结构的发现，可能会让我们重新思考线虫的进化。线虫拥有巨大的物种多样性，估计多达 1000 万种不同物种中，仅描述了 30000 种。各种线虫物种的口器在形态上呈现复杂性和多样性，以适应差异的生活环境和生活方式。基于该研究的实验结果，可以推断几丁质在进化过程中对线虫口器结构的分化是非常重要的，而且，我们也有理由相信几丁质可能是无脊椎动物多样化最重要的大分子。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cub.2022.11.011

第一作者：孙帅

（照片提供自：孙帅团队）

作者简介（上下滑动阅读）

第一作者

孙帅博士，2017年硕士毕业于东北师范大学分子表观遗传学教育部重点实验室，师从刘宝教授，硕士期间研究方向为水稻种间杂种劣势及水稻异源多倍体中的非整倍化现象。2022年博士毕业于德国马克思普朗克生物研究所（图宾根）综合进化生物学系，合作导师为Dr. Ralf Sommer，主要研究方向为构建高分辨率的单线虫转录组图谱，研究节律基因在线虫进化和发育过程中的作用。博士期间的主要成果以第一作者在国际权威学术期刊Genome Research、Current Biology、Genetics发表，这些成果得到国家留学基金委和马克思普朗克研究所资助支持。孙帅博士即将加入哈佛医学院Dr. Danesh Moazed研究组进行博士后研究，研究方向为与节律基因表达模式关联的表观遗传学调控机制。

通讯作者

Prof. Dr. Ralf Sommer,德国图宾根马克斯普朗克生物学研究所 (MPI) 综合进化生物学系主任，图宾根大学荣誉教授，欧洲分子生物学组织（EMBO）成员，现担任Journal of Nematology主编。Dr. Ralf Sommer 是模式线虫 P. pacificus的开创者，他率领的研究团队长期专注于线虫发育和进化、表型可塑性、线虫捕食行为和自我识别等研究方向。研究成果发表在在国际权威学术期刊Nature、Cell、Science和Nature Genetics等。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Bento G, Ogawa A, Sommer RJ. Co-option of the endocrine signaling module dafachronic acid-DAF-12 in nematode evolution. Nature 2010;466(7305):494–497.

[2] Ragsdale, E. J., Müller, M. R., Rödelsperger, C., & Sommer, R. J. (2013). A developmental switch coupled to the evolution of plasticity acts through a sulfatase.Cell, 155(4), 922-933.

[3] Sieriebriennikov B, Prabh N, Dardiry M, Witte H, Roseler W, Kieninger MR, Rodelsperger C, Sommer RJ. 2018. A Developmental Switch Generating Phenotypic Plasticity Is Part of a Conserved Multi-gene Locus. Cell Rep 23: 2835-2843.e4.

[4] Sieriebriennikov B, Sun S, Lightfoot JW, Witte H, Moreno E, Rodelsperger C, Sommer RJ. 2020. Conserved nuclear hormone receptors controlling a novel plastic trait target fast-evolving genes expressed in a single cell. PLoS Genetics 16: 1–27.

[5] Sun, S., Theska, T., Witte, H., Ragsdale, E. J., & Sommer, R. J. (2022). The oscillating Mucin-type protein DPY-6 has a conserved role in nematode mouth and cuticle formation.Genetics, 220(3), iyab233.

[6] Lightfoot, J. W., Wilecki, M., Rödelsperger, C., Moreno, E., Susoy, V., Witte, H., & Sommer, R. J. (2019). Small peptide–mediated self-recognition prevents cannibalism in predatory nematodes.Science, 364(6435), 86-89.

[7] Sun, S., Rödelsperger, C., & Sommer, R. J. (2021). Single worm transcriptomics identifies a developmental core network of oscillating genes with deep conservation across nematodes.Genome research, 31(9), 1590-1601.

本文完