干货分享 | 基因毒性杂质的法规、来源、检测、控制（第二期）
卤代烷烃的致突变性机理、来源、检测方法与案例分析（上）
卤代烷烃广泛用于制药工艺中。许多卤代烷烃都经过了致癌和致突变活性测试。一般来说，潜在的遗传毒性取决于卤素的性质、数量和位置以及化合物的分子大小。
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致突变机理
1.1 单卤代物
卤代烷烃作为潜在基因毒性杂质，其致癌机理尚未完全理清，但已经有研究证明，其可以直接与关键的生物活性大分子如蛋白质和DNA等反应。
生物转化也可能在其毒性中发挥重要作用。单卤甲烷肝脏代谢的第一步是与谷胱甘肽（GSH）结合，从而形成S-甲基谷胱甘肽。这种物质最终可能转化为甲硫醇，这被认为是有毒的代谢物。或者，甲醛的产生可能会导致细胞损伤。甲醛可能来源于细胞色素P450对母体化合物的直接氧化或甲硫醇的代谢。
1.2 二卤代物
大多数二卤代烷烃可以通过与细胞色素P450氧化或GSH结合被激活。关于1,2-双功能烷烃，有人假设它们中的大多数能够通过GSH依赖的途径引起遗传毒性损伤。具体而言，对于二卤乙烷，GSH结合途径涉及半芥形成和假定的反应性环硫离子，其最终产生N7鸟苷加合物作为主要DNA加合物。
1.3 氮芥、硫芥
氮芥和硫芥是潜在的烷基化剂。其作用机理如下图所示，卤素离去产生碳离子，该碳离子可通过环化成氮杂环丙烷/环硫离子（1）而部分稳定。这种反应性中间体与DNA中的鸟嘌呤碱反应，形成N7烷基化鸟嘌呤衍生物（2）。鸟嘌呤单加合物可形成另一反应性氮丙啶/环磺酸中间体（3），其可与水反应形成2-羟乙基单加合物（4），或与第二鸟嘌呤残基反应形成链间交联（5）。
芥子气（二氯乙基硫化物）已被广泛用作战试剂。之后，它们的细胞毒性潜力被揭示，它们作为原型化疗药物的用途也得到了推广。这类化合物的高度细胞毒性归因于它们通过诱导细胞凋亡来抑制复制的能力。
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来源
2.1 反应试剂
卤代烷烃广泛的用于原料药的合成，最常见的方式是作为C，N，O, S 的烷基化反应。典型的例子如下所示：
● C-烷基化
在强碱作用下，可采用卤代烷烃进行C-烷基化。
非索芬那定(Fexofenadine)使用碘甲烷作为C-烷基化试剂。
除此之外，还有傅克反应、格氏反应等。下图的例子为盐酸苯海索合成过程中，氯代环己烷参与格氏试剂反应。
● N-烷基化
在N-烷基化试剂中非常重要一类是氮芥（nitrogen mustard），用于哌嗪的合成。
阿立哌唑（Aripiprazole）合成过程中，使用了氮芥合成哌嗪，以及双卤代烷烃作为N-和O-烷基化试剂。
卤代烷烃还可用于季胺盐的生成，如米拉美林（Milameline）合成过程中，使用碘甲烷对吡啶进行烷基化，后进行还原获得最终产物。
● O-烷基化（羟基、羧基）
羟基和羧羟基均可用卤代烷烃进行烷基化，生成醚或者酯。
西立伐他汀钠（Cerivastatin）中使用碘甲烷作为羟基O-烷基化试剂。
拉坦前列腺素（Latanoprost）使用2-碘丙烷与羧基反应生成酯。
● S-烷基化
依达麦布（Eldacimibe）使用碘甲烷作为硫甲基化试剂。
● 卤代烷烃试剂中的杂质与反应副产物
在卤代烷烃参与反应的生产工艺中，除了评估卤代烷烃本身的基毒作用，还需注意其自身可能含有其他卤代化合物杂质，以及其在反应过程中发生的卤素交换而生成的其他杂质。
例如，奥美沙坦酯(OLM)的重要起始物料Ｎ-(三苯基甲基)-５-(４′-溴甲基联苯-２-基)四氮唑(BBTT1)含有约1%-2%的二溴代杂质Ｎ-(三苯基甲基)-５-(４′-二溴甲基联苯-２-基) 四氮唑(BBTT2)反应中均会脱掉三苯甲基保护基分别生成５-(４′-溴甲基联苯-２-基) 四氮唑(BBT1) 和５-(４′-二溴甲基联苯-２-基)四氮唑(BBT2) 。
又如，苯甲酸阿格列汀的合成过程中，2-氰基溴苄和6-氯尿嘧啶作为起始物料。而合成2-氰基溴苄的主要原料便是邻二溴甲基苯腈，6-氯尿嘧啶也会导致在生产的过程中发生卤素交换，生成2-氰基氯苄。
2.2 HX醇
除了直接使用卤代烷烃之外，如果反应在醇类溶剂中进行，同时存在卤化烃又或者碱金属卤化物与强酸的组合时，尤其是反应温度比较高时，便有产生卤代烷烃的风险。这些反应条件常用于环化、脱羧、脱磺酰基以及成盐反应。
● 环化
卡培他滨（Capecitabine）合成过程中，在HCl/MeOH下，使用丙酮对二醇进行保护，在此过程中有产生MeCl的风险。
西他列汀（Sitagliptin）的合成使用HCl/MeOH催化三氮唑的生成，在此过程中亦有产生MeCl的风险。
● 醇解
在珍米洛非班（Xemilofiban）合成中，采用HCl/EtOH是β-内酰胺开环，并形成乙酸酯。在此过程中有产生EtCl的风险。
● 脱羧
舒尼替尼（Sunitinib）合成过程中使用HCl/EtOH脱羧，在此过程中有产生EtCl的风险。
● 脱磺酰基
硼替佐米（Bortezomid）合成过程中，使用HCl/MeOH脱N-亚磺酰基，在此过程中有产生MeCl的风险。
● 成盐
很多API都采用卤化氢的醇溶液进行成盐，在该过程中，均有产生卤代烷烃的风险。如盐酸吡格列酮合成过程中，使用HCl/EtOH成盐。
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下期内容
卤代烷烃的检测方法及案例分析
● 参考文献
[1] Mechanisms of Chemical Carcinogenicity and Mutagenicity: A Review with Implications for Predictive Toxicology, Chem. Rev. 2011, 111, 2507–2536.
[2] Genotoxic Impurities in Pharmaceutical Manufacturing: Sources, Regulations, and Mitigation， DOI: 10.1021/cr300095f
[3] 基因毒性杂质分析方法和前处理技术研究进展，药物分析杂质，2018, 38（10）
[4] GC-MS/MS法测定苯甲酸阿格列汀中基因毒杂质 2-氰基氯苄和邻二漠甲基苯腈的含量，中国药品标准, 2022 , 23 ( 1)
[5] HPLC-MS 测定奥美沙坦酯中有关基因毒性杂质，中国药科大学学报，2019年50(3):325-329.
[6] Determination of trace level genotoxic impurities in small molecule drug substances using conventional headspace gas chromatography with contemporary ionic liquid diluents and electron capture detection, Journal of Chromatography A, 1361 (2014) 217–228
[7] Control and analysis of alkyl and benzyl halides and other related reactive organohalides as potential genotoxic impurities in active pharmaceutical ingredients (APIs)，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 48 (2008) 497–507
[8] Development and validation of a sensitive GC–MS method for the determination of trace levels of an alkylating reagent in a β-lactam active pharmaceutical ingredient， Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 39 (2005) 486–494
[9] Enhancing the detection sensitivity of trace analysis of pharmaceutical genotoxic impurities by chemical derivatization and coordination ion spray-mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 302–306
[10] A new HPLC-UV derivatization approach for the determination of potential genotoxic benzyl halides in drug substances, RSC Adv., 2019, 9, 25797
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斯坦德科创研究经验
斯坦德科创对各种原料药和制剂中卤代烷烃的检测，已经有相当丰富的经验，根据样品性质进行直接进样、顶空进样或者衍生化处理，采用GC、GC-MS、HPLC、LC-MS等多种方法进行方法学开发和验证。
生物医药是斯坦德集团的核心领域之一，业务涵盖药物研发CRO服务、药学研究、相容性研究、密封性研究、药物标准检测服务、生物制品研发测试服务、生物安全研发测试服务等领域。我们致力于为客户提供研发、分析及检测一站式服务，可有效助力企业缩短研发周期，让药品与医疗器械更快更安全的上市。
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专家访谈 | 稼穑蓬勃，梦想熠熠—斯坦德生物医药高端制剂专家杨勇
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